响应面法优化湖北海棠果实多酚提取工艺

张乔会 黄晶晶 熊坤

摘要：以湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd]果实为原料，采取醇提法提取多酚，在单因素试验的基础上，对提取工艺进行响应面优化，响应面模型R2=0.990 4，P<0.001，模型对试验实际情况拟合较好，显著性高。结果表明，优化后的提取工艺参数为提取溶剂乙醇浓度61%，提取时间3.0 h，液料比21∶1，提取温度85 ℃，并在此工艺参数条件下，湖北海棠果实提取液中多酚含量平均值为11.89 mg/g。

关键词：湖北海棠（Malus hupehensis（Pamp.）Rehd）;多酚;提取;响应面

中图分类号：S132         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）14-0117-05

Abstract： Polyphenols extracted from the fruit of Malus hupehensis（Pamp.）Rehd. On the basis of single factor experiments，the optimum conditions for the extraction of the polyphenols were obtained through Box-Benhnken center-united experiment design and response surface methodology. Response surface model R2 was 0.990 4，P<0.001，the model was highly significant and fitted well with the actual situation of the test. The results showed that the optimum conditions of extraction of the polyphenols were as follows： ethanol concentration 61%，time 3.0 h， liquid to raw material ratio 21∶1， temperature 85 ℃. Under this condition，the maximal yield of polyphenols was up to 11.89 mg/g.

Key words： Malus hupehensis（Pamp.）Rehd; polyphenols; extraction; response surface methodology

湖北海棠[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd]属蔷薇科苹果属植物[1]，分布于湖北等黄河以南地区的19个省区[2]。湖北海棠抗白绢病和白纹羽病，耐涝性、耐旱性较强，抗气温变化范围大，可以耐受-28～40 ℃的气温变化，在中国南方地区资源蕴藏量较大[3]。湖北海棠枝叶及根等组织部位化学成分丰富，已有学者对其进行了一定的研究，如叶以含有多酚[4]、黄酮类物质[5，6]、根皮苷及矿物质等。从湖北海棠中提取的天然产物如黄酮类物质等具有降低血糖[7，8]、抗脂质过氧化[9]、抗氧化[10]、抗骨质疏松[11，12]等作用。其果实作为植物的组成部分，也应含有相似的成分，具有相似的生理功能。但湖北海棠果实小而多，味酸涩，目前对其开发利用极少，资源浪费严重。本研究以湖北海棠果实为原料，提取其中的酚类物质，探讨利用响应面法[13]优化了其提取工艺，为其开发利用提供基础依据。

1  材料与方法

1.1  原料及试剂

湖北海棠果实采自湖北省恩施土家族苗族自治州，洗净后80 ℃烘干，粉碎过80目篩备用。

没食子酸、无水乙醇、酒石酸钾钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、铁氰化钾等均为分析纯。

1.2  仪器设备

GL型粉碎机、FA2104型电子天平、SHZ-III型循环水式多用真空泵、UVWIN5型紫外可见分光光度计、HWS-12型恒温水浴锅、R-210型旋转蒸发仪、HWS-12型恒温水浴锅、TD5A型台式低速离心机、DZF型真空干燥箱、202-1A型电热恒温干燥箱。

1.3  方法

1.3.1  多酚的提取  利用多酚易溶解于醇等极性强溶剂的特性，使用50%～90%乙醇溶液进行提取[14]，将采集得到的果实烘干粉碎，过80目筛，取一定量的果实粉末放入三角瓶中，按一定比例加入一定量的50%～90%乙醇溶液，在一定的温度下进行醇提。

1.3.2  多酚的检测  采用洒石酸亚铁比色法，即按GB8313.87方法[15]，吸取1 mL待测液放入25 mL的棕色容量瓶中，加入4 mL去离子水，5.0 mL的酒石酸亚铁溶液，摇匀。用pH 7.5磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀静置15 min在540 nm波长处测定吸光度，计算多酚含量。

1.3.3  湖北海棠果实多酚提取的单因素试验

1）提取温度。设定提取液料比20∶1、乙醇浓度60%、提取时间1.5 h，分别在50、60、70、80、90 ℃的温度下水浴浸提，在该条件进行试验，考察不同提取温度对湖北海棠果实多酚提取的影响。

2）料液比。设定乙醇浓度60%、提取时间1.0 h、提取温度70 ℃，分别按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入提取液进行提取试验，考察不同料液比对湖北海棠果实多酚提取的影响。

3）提取时间。设定提取液料比20∶1、乙醇浓度60%、提取温度70 ℃，分别在水浴条件下浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察不同提取时间对湖北海棠果实多酚提取的影响。

4）乙醇浓度。设定提取料液比1∶15、提取時间1.0 h、提取温度70 ℃，分别用浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作为提取液，考察不同浓度乙醇提取液对湖北海棠果实多酚提取的影响。

1.3.4  湖北海棠果实多酚提取的响应面优化设计  在单因素试验的基础上，参考文献[16，17]，运用Design expert 7. 1软件程序，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[5，15]，采用4因素3水平的响应面分析法，以提取温度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、乙醇浓度（D）为自变量，以提取液中多酚含量为响应值，通过响应曲面分析（Response surface analysis，RSA）对提取条件进行优化。

1.4  数据处理

试验数据的处理分别采用Microsoft Excel、Design Expert 7.1等软件进行。

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果

2.1.1  提取温度  不同提取温度对湖北海棠果实多酚提取液中多酚含量的影响如图1所示。随着提取温度升高，多酚含量逐渐升高，当温度为80 ℃时含量达到最高，然后随着温度的增加，含量逐渐下降，这可能是由于提取温度过高，使多酚类物质氧化变性等。

2.1.2  液料比  不同液料比对湖北海棠果实多酚提取得率的影响如图4所示。结果表明，提取液中多酚含量随着液料比的增加而升高，当液料比达到20∶1时，得率达到最高，随后继续增加液料比，多酚含量降低，这可能是由于液料比达到20∶1时，果实多酚溶出达到最大，之后随着料液比的增加，反而稀释了溶液，从而使得提取液中多酚含量的降低。

2.1.3  提取时间  提取时间对湖北海棠果实多酚得率的影响如图2所示。随提取时间延长，湖北海棠果实提取液中多酚含量不断升高，当提取2.0 h后，增加的趋势略有降低，可能是随着提取时间的增加，在加热的条件下，部分多酚类物质发生了氧化反应等[18]。

2.1.4  乙醇浓度  提取溶剂乙醇浓度对湖北海棠果实总多酚提取得率的影响如图3所示。结果表明，随着乙醇浓度的增加，提取液中多酚含量逐渐升高，当乙醇浓度达到60%时，其含量达到最高，然后随着乙醇浓度的增加，提取液中多酚含量逐渐下降，乙醇浓度过高不利于多酚类物质的析出，并且会使蛋白质等生物大分子变性沉淀，阻碍多酚类物质从组织细胞向溶剂中扩散。

2.2  湖北海棠果实多酚提取响应面试验结果

2.2.1  响应面模型回归分析  以提取温度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、乙醇浓度（D）为变量，以提湖北海棠果实提取液中多酚含量为响应值，按响应面软件Design expert 7.1提供设计的组合进行试验，结果见表2。

采用Design expert 7.1软件程序对试验数据进行回归分析，得到湖北海棠果实多酚含量的回归方程如下：y=11.34+0.35A+0.20B+0.33C+0.31D-0.035AB+0.27AC+0.015AD-0.052BC-0.057BD-0.13CD-0.45A2-0.53B2+0.061C2-0.80D2。

对拟合的二次模型进行方差分析，结果见表3。F为88.06，多元相关系数为R2=0.990 4，预测R2=0.944 6，调整R2adj=0.979 1，说明模型对试验实际情况拟合较好;P<0.001（P<0.05视为模型拟合显著），表明该模型高度显著，可用来进行提取湖北海棠多酚响应值的预测。

对模型中回归系数的显著性进行检验分析，结果如表4所示。因素A、B、C、D与提取液中多酚含量的线性效应显著;因素AC、CD对多糖提取率的交互效应显著;因素A2、B2、D2对多糖提取率的曲面效应极显著;而因素AB、AD、BC、BD对多糖提取率的交互效应不显著。4个因素均不同程度地对响应值产生显著或极显著的影响。

2.2.2  响应面图形分析  根据回归方程，作出响应面和等高线图，考察拟合响应曲面的形状，提取温度、料液比、提取时间和乙醇浓度对湖北海棠果实提取液中多酚含量的影响，如图5所示，等高线的形状可以反映出交互相的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。由二次响应面回归模型方差分析及响应面图形及结合单因素分析可知，提取时间及提取温度响应明显，乙醇浓度及提取时间交互响应明显。

2.2.3  最佳闪提工艺条件的确定  通过Design Expert 7.1软件对湖北海棠果实多酚提取工艺条件进行优化，进一步得到较优工艺参数为提取温度85.2 ℃，液料比21.12∶1，提取时间3.0 h，乙醇浓度61.75%，在此条件下，湖北海棠果实提取液中多酚含量预测值为11.96 mg/g。为便于试验操作，在实际操作中将以上工艺参数修正为提取溶剂乙醇浓度61%，提取时间3.0 h，液料比21∶1，提取温度85 ℃，并在此工艺参数条件下进行3次平行试验，测得湖北海棠果实提取液中多酚含量平均值为11.89 mg/g，与预测值相差很小，说明该模型与实际拟合度良好，结果可靠，优化数据可信，可作为提取优化参数。

3  结论

以湖北海棠果实为原料，采取醇提法提取多酚，提取时间及提取温度响应明显，乙醇浓度及提取时间交互响应明显。提取优化工艺参数为提取溶剂乙醇浓度61%，提取时间3.0 h，液料比21∶1，提取温度85 ℃，并在该工艺参数条件下进行3次平行试验，实际测得湖北海棠果实提取液中多酚含量平均值为11.89 mg/g。

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