基于ITSr DNA高通量测序方法研究玉米粉碎粒度对奶牛瘤胃真菌菌群的影响

吉武龙，郭 成，胡丹丹，张力莉，徐晓锋

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

瘤胃中的微生物是反刍动物进行消化的主要执行者，在反刍动物的消化过程中承担了非常重要的角色。瘤胃真菌在瘤胃微生物中占8%～20%，在纤维降解的过程中起到了极其重要的作用（Edwards等，2017）。瘤胃真菌能分泌一些高活性的酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、半乳糖醛酸酶等13种酶（雷威等，2005）。目前从瘤胃中分离得到的真菌共计5个属十余个种，其有溶解纤维的特性，并且都具有降解植物细胞壁中结构性碳水化合物的能力（于长青等，2004）。瘤胃真菌的数量随日粮纤维含量的变化而变化：日粮中粗饲料含量较高时，瘤胃中真菌数量也较高；相反，日粮中淀粉或谷物含量较高时，则真菌数量较少（邓凯东，1998）。瘤胃真菌不仅可以通过纤维素酶来降解纤维素，还可以通过物理方式降解纤维素，主要是从孢子囊中释放出的游动孢子可游动到易于集聚的植物组织部位，穿透牧草角质层屏障,降解无法被细菌和纤毛虫降解的木质素纤维物质（于长青等，2004；毛胜勇等，2000；邓凯东，1998）。瘤胃真菌不仅可以分泌一些纤维素降解酶，而且可以产生α-淀粉酶及淀粉葡萄糖苷酶来降解淀粉（于常青，2004）。粉碎粒度会影响玉米淀粉瘤胃降解速度，本试验旨在用细粉碎玉米代替占日粮10%干物质的破碎玉米，通过ITSrDNA高通量测序技术研究其对奶牛瘤胃真菌菌群多样性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理 选用4头体况良好，泌乳20 d左右，日产奶量大约为30 kg，体重（550±35）kg的经产（二胎）中国荷斯坦奶牛为试验动物。试验奶牛采用TMR饲喂方式。

1.2 试验日粮 根据NRC（2001）奶牛饲养标准配制日粮，日粮组成和营养成分见表1。

1.3 试验设计 采用2×2交叉试验设计，对照组奶牛日粮添加10%的破碎玉米。试验组由细粉碎玉米代替该比例破碎玉米，每个阶段试验期为21 d，预饲期14 d，正试期7 d。

表1 奶牛试验日粮组成及营养成分

1.4 样品采集与处理 通过牛口腔导管采集瘤胃液，采集时间分别为饲喂前0 h和饲喂后2、4、6 h，每期连续3 d（16、17、18 d）取样。为获得具有代表性的样品，每天4个时间点所取的瘤胃液样品经混匀后各取5 mL，充分混合装入离心管中，放置于-80℃冻存。将3 d样品混合均匀后取1.5 mL用冻存管保存。

1.5 DNA样品提取、扩增和Miseq测序 将-80℃冻存的8个瘤胃液样品4℃溶解，轻微颠倒混匀，静置5 min，取上清液1 mL转入1.5 mL离心管中，送往广州基迪奥生物科技有限公司进行DNA样品提取、扩增、纯化、均一化，制备Miseq文库、采用Hiseq2500 PE250上机测序。采用1%的琼脂糖凝胶电泳，在100V恒定电压下，电泳30 min，采用NanoDrop 2000检测提取DNA条带的质量。从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增ITSrDNA的ITS2区。引物 设 计（F：GCATCGATGAAGAACGCAGC；R：ATATGTAGGATGAAGAACGYAGYRAA）。然 后PCR扩增产物切胶回收，用QuantiFluorTM荧光计进行定量。 将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，最终利用Hiseq2500 PE250上机测序。

1.6 数据处理与分析 数据经Excel初步整理后，采用SAS 8.2中两阶段交叉设计的方差分析对数据进行分析，采用最小显著法LSD进行差异显著性比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，结果以“平均数±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 样品OTU分布 为获得样品中物种的多样性信息，首先对tags进行OTU（Operating Taxonomic Unit）聚类，利用Mothur（v.1.34.0）计算0.03距离下（97%的相似度）的OTU数量。由图1可以看出，试验组的OTU为258，对照组的OTU为229，其中两组共有的OTU为105，试验组单独有的OTU为153，对照组单独拥有的OTU为124，从总体数量来看，试验组的OTU数量多于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。

2.2 菌群alpha多样性分析 Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括Chao值、Ace值、Shannon指数以及Simpson指数等。Chao值和Ace值两个多样性估算指数是根据所测得的tags数和OTU的数量以及相对比例来预测样品中微生物的种类（OTU的数量）。由表2可知，试验组的Chao值和Ace值均高于对照组，但两组的差异不显著（P＞0.05）。Shannon指数也高于对照组，Simpson指数低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。试验结果说明用细粉碎玉米代替破碎玉米（10%DM）并未改变奶牛瘤胃真菌菌群的多样性与丰富度。

图1 对照组和试验组瘤胃中真菌OTUs韦恩图

表2 样品多样性指数

2.3 奶牛瘤胃真菌菌群结构的变化

2.3.1 门水平 如表3所示，从本试验的奶牛瘤胃内真菌的菌群门水平结构可以看出，试验组和对照组的子囊菌门、担子菌门、新丽鞭毛菌门、未培养菌门（Fungi_NA）差异均不显著（P＞0.05），接合菌门（Zygomycota）的丰度有明显的上升趋势（P=0.051），试验组和对照组在门水平上的差异不显著，说明用细粉碎玉米代替破碎玉米（10%DM）并未改变奶牛瘤胃真菌菌群门水平上的结构。

表3 奶牛瘤胃真菌门水平%

2.3.2 属水平 如表4所示，从属水平的瘤胃液真菌区系物种组成分析，在已知的瘤胃液真菌区系中，德巴利酵母属（Debaryomyces）、曲霉属（Aspergillus）、瘤胃壶菌属（Piromyces）、蜡孢属（Ceriporia）、酵母菌属（Saccharomyces）的相对丰度均在5%以上，其中未分类菌属的相对丰度为19.3%，以上为瘤胃液真菌区系的优势菌属。试验组与对照组相比，德巴利酵母属的相对丰度降低幅度较大，但组间差异并不显著（P＞0.05）。试验组根囊鞭菌属显著增加（P＜0.05）。其他优势菌属组间差异不明显（P＞0.05）。念珠菌属（Candida）、瘤胃 真 菌 属 （Cae comyces）、NA（Neocallimastigaceae）、新丽鞭毛菌属（Neocallimastix）、霉菌属（Mycosphaerella）、青霉属（Penicillium）、核盘菌属（Sclerotinia）、根囊鞭菌属（Orpinomyces）、帚枝霉属（Sarocladium）等相对丰度为0.5%～5%的菌属为次优势菌属；这些次优势菌属在对照组与试验组组间差异不显著（P＞0.05）。试验组其他真菌虽然也有检出，但是其相对丰度较低，其中柄孢壳属（Zopfiella）以及被孢霉属（Mortierella）显著增加（P＜0.05）。

表4 奶牛瘤胃真菌属水平%

3 讨论

3.1 玉米粉碎粒度对瘤胃液真菌菌群丰度及多样性的影响 本试验是基于Hiseq2500 PE250高通量测序平台对8个样本的瘤胃液真菌区系的ITS2区进行测序，对瘤胃液真菌区系的多样性进行定性分析，测序结果可从测序深度和覆盖度两个角度进行评估。本试验8个样本的优质序列数总和为158120条，平均每个样本19765条，低于张红涛（2017）对荷斯坦后备牛的真菌测序深度（5.13万条），但是高于韩旭峰（2015）对陕北白绒山羊的测序深度（15531条），也高于Kumar（2015）围产期奶牛瘤胃真菌测序深度（3558条）。同时本试验的8个样本的真菌区系测序覆盖度均超过98.5%，高于张红涛（2017）对荷斯坦后备牛瘤胃真菌区系测序覆盖度（98%）。本试验测序结果基本可以反映出奶牛瘤胃真菌区系中的大部分物种。

瘤胃真菌区系种类与数量受日粮的影响。Boots等（2013）研究发现，饲喂高粗日粮后瘤胃真菌区系的物种丰富度较高。Kumar等（2015）研究表明，产后中等粗料水平（50%粗料）比产前奶牛高粗料水平（80%粗料）的瘤胃真菌区系物种丰富度和多样性显著下降。Ishaq等（2017）研究显示，奶牛因饲喂高谷物饲料，处于亚急性酸中毒时，则会降低瘤胃真菌的菌群丰度和多样性。通过本试验可以看出，试验组与对照组的菌群丰富度指数Chao值和Ace值差异不显著，菌群多样性指数Shannon指数与Simpson指数也未呈现显著差异。说明本试验条件下，用细粉碎玉米替代破碎玉米（10%DM）并未显著影响奶牛瘤胃真菌的多样性与丰富度。

3.2 玉米粉碎粒度对瘤胃液真菌菌群结构的影响 从门水平瘤胃液真菌区系菌群分布可以看出，子囊菌门、新丽鞭毛菌门在试验组和对照组中均为优势菌门，与张红涛（2017）和Liggenstoffer（2010）等研究结果一致。新丽鞭毛菌门广泛存在于奶牛、羊的瘤胃中，其在纤维的消化过程中发挥着至关重要的作用，主要是通过假根对植物组织的细胞壁进行分解，从而达到分解纤维的目的。本试验结果显示，担子菌门也为优势菌门，与上面研究结果不同，这可能是因为日粮不同所引起瘤胃真菌菌群的变化。

从属水平瘤胃液真菌区系菌群分布可以看出，德巴利酵母属、曲霉属、瘤胃壶菌属在已知的属水平中为优势菌属。细粉碎玉米替代破碎玉米之后，奶牛瘤胃德巴利酵母属的菌群丰度降低达73%，但组间差异并不显著。Wang（2011）等研究表明，新丽鞭毛菌属具有纤维降解酶或木聚糖酶活性。因此主要在降解纤维方面发挥作用，细粉碎玉米瘤胃降解速度比破碎玉米快，瘤胃内的pH降低。王照华等（2005）研究表明，精粗比增加瘤胃厌氧真菌数量下降、优势菌形态发生变化、挥发性脂肪酸浓度增加、pH显著降低。厌氧真菌发酵葡萄糖、纤维素等碳水化合物后的主要代谢产物为甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、CO2及H2（孙美洲，2014）。瘤胃pH降低抑制了德巴利酵母属的增殖，本试验结果表明，细粉碎玉米替代破碎玉米之后，奶牛瘤胃德巴利酵母属的菌群丰度降低达73%，但组间差异并不显著，说明瘤胃部分真菌区系种类与数量受到个体差异因素的影响。蜡孔菌也呈现与德巴利酵母属一样的趋势，试验组与对照组比较降低幅度达100%，但组间差异并不显著，目前关于瘤胃蜡孔属的研究鲜见报道。孙云章等（2007）研究显示，随着日粮精料比例的增加，α-淀粉酶的活性呈上升趋势，可能是因为精料的含量增加，诱导α-淀粉酶的产生。Dagar（2011）等研究证实，根囊鞭菌属具有降解淀粉等非结构性碳水化合物酶活性。本试验结果表明，试验组相比于对照组，根囊鞭菌属的菌群丰度显著升高（P＜0.05）。其他相对丰度较低的真菌，如试验组柄孢壳属（Zopfiella）与被孢霉属 （Mortierella）增加明显 （P＜0.05），但在瘤胃的功能目前鲜见报道。

4 小结

在本试验条件下，用细粉碎玉米替代破碎玉米（10%DM）并未显著影响奶牛瘤胃真菌的多样性与丰富度。在门水平上，用细粉碎玉米替代破碎玉米对瘤胃真菌影响差异不显著；在属水平上，德巴利酵母属等优势菌属有一定程度的下降，而根囊鞭菌属显著上升。