高效液相色谱法测定甜菜碱的含量

张倩茹　尹蓉　殷龙龙　王贤萍　孙慧英　梁志宏

摘 要：选用Supersil SCX 5μm高效液相色谱柱，柱温30℃，流动相为0.01M甲酸铵-甲醇∶水85∶15（v/v）溶液，流速1.0mL/min，建立了高效液相色谱-示差检测器测定甜菜碱的方法。该方法线性关系良好，其线性回归方程为y=108284x-23952，相关系数R2=0.9994，甜菜碱的加标回收率为99.45%～100.63%，为甜菜碱的检测提供了一种快速高效的方法，且灵敏度高，重复性好，简便易行。

关键词：高效液相色谱;甜菜碱;甲醇

中图分类号 S566.3文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）15-0011-03

Determination of Betaine by High Performance Liquid Chromatography

Zhang Qianru1 et al.

（1Institute of Pomology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Shanxi Key Laboratory of Germplasm Improvementand Utilization in Pomology，Taiyuan 030031，China）

Abstract：An high performance liquid chromatography method for determination of betaine was built up. The Supersil SCX 5μm high performance liquid chromatography column was selected，the column was set at 40℃，using 0.01mol/L ammonium formate methanol∶water 85∶15（v/v） solution as mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. The results showed that the method has a good linear relationship and high sensitivity，y=108284x-23952，R2=0.9994，the recovery rate between 99.45%-100.63%.This method provided a fast and efficient for determination of betaine，which was sensitive repeatable and easy to use.

Key words：High Performance Liquid Chromatography;Betaine;Methanol

甜菜碱19世纪在欧洲被发现，其功效在20世纪70年代被认识。因其是动植物代谢的中间产物，所以动植物體内都含有甜菜碱，其中全谷物、菠菜、虾和甜菜含有丰富的甜菜碱[1-3]。人体中几乎所有组织中都含有甜菜碱，肝脏、肾脏和睾丸中的浓度最高，血液质粒中的含量在20～70μmol/L，是人体所需重要的营养物质[4]。甜菜碱在哺乳动物的生理和其他方面都起着重要作用，肾脏、肝脏和其他器官都含有表达特定运输系统的细胞，从而调节其从血液中对甜菜碱的摄取和积累[5-6]。甜菜碱可促进蛋白质合成，提高冷适应，作为冷冻保护剂，在甲硫氨酸等循环中作甲基供体，保护线粒体，提高脂肪组织胰岛素敏感性，增加牲畜的瘦肉量，改变细胞体积调节渗透压;作为饲料添加剂用于鲑鱼等养殖，能提高植物耐盐力及光合作用能力[1，7-11]。

据文献报道，现阶段对甜菜碱含量的测定方法有滴定法、分光光度计比色法、离子色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱联仪法等。周畅[12]等采用比色法测定海产品中甜菜碱含量，吴燕[13]等采用比色法测定枸杞子中甜菜碱含量，杨雪[14]等用非水滴方法和离子色谱法比较了5种产品的甜菜碱含量，吴英键[15]采用高效液相色谱-电喷雾检测器法测定枸杞子中甜菜碱的含量，张弦飞[16]等采用超高效合相色谱-串联质谱法快速测定枸杞中甜菜碱含量，张文昔[17]等也采用超高效液相色谱-串联质谱法测定了海藻肥中的甜菜碱。

一般在检测甜菜碱时，应根据实际情况结合实验室条件和测定要求选择适当方法。滴定法、分光光度计比色法成本低，操作简单，样品前处理相对容易，对实验室设备要求较低，但分析时间较长且重复性、准确性差，适合小型企业或农户。离子色谱法、超高效液相色谱法、超高效液相色谱质谱联仪法，专属性较强、检测速度快、灵敏度高，但样品前处理复杂，且对试验人员技术及操作条件控制要求高，仪器设备昂贵，适合大型企业、科研院所和高校。鉴于甜菜碱在我国农业、饲料工业、养殖业中的作用本研究采用高效液相色谱-示差检测器法测定甜菜碱，探索此方法测定甜菜碱含量的可行性和准确率，旨在选择一种同时兼具测试准确、灵敏度高但成本较低且操作简单的方法，以期对饲料、植物等中甜菜碱的检测及质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 甜菜碱（标准品），甲醇（色谱纯，默克），甲酸铵（色谱纯，国药），屈臣氏纯净水。超声波清洗器（KQ-250DB型，昆山市超声波仪器有限公司）;e2695高效液相色谱系统（包括：2414型示差折光检测器;柱温箱;Empower色谱工作处理站，Waters公司）;圆形固相萃取装置（USE-12C型，北京优晟联合科技有限公司）;SCX SPE固相萃取小柱（硅胶为基质的强阳离子交换萃取柱，键合有苯磺酸官能团）。

1.2 色谱条件设置 色谱柱：Supersil SCX 300A 5μm阳离子交换柱;流动相：0.01M甲酸铵-甲醇∶水85∶15（v/v）溶液（称取0.63g的甲酸铵，置于1000mL容量瓶中，加入150mL纯净水，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，超声后过0.45μm无机滤膜）;流速：1.0 mL/min;柱温：30℃;进样量10μL。

1.3 标准曲线的绘制 配制0.00（空白）、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00mg/mL的甜菜碱溶液，设定自动进样程序，进样量10μL，每一浓度重复3次，在上述条件下，甜菜碱大约在5.096min左右出峰，色谱图见图1，测定甜菜碱峰面积，取同一浓度下3次峰面积平均值，以甜菜碱浓度为横坐标，相对应的甜菜碱峰面积为纵坐标，绘制甜菜碱标准曲线，见图2。

1.4 数据处理 采用Excel 软件进行数据整理;采用SPSS 软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件 通过调整流动相成分比，比较出峰时间与峰型，最终确定适合的的流动相成分及比例。试验选择0.01M甲酸铵-甲醇-水95∶5（v/v）、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25溶液，在0.2～1.0mL/min范围内改变流动相流速，在25～50℃范围内改变柱温，进样量10μL，进行色谱条件的组合试验。结果表明：流动相中甲醇比例越高，出峰时间越早，分离效果越差，因此选择0.01M甲酸铵-甲醇∶水85∶15（v/v），流动相为1.0mL/min，柱温30℃，测定的准确度高、被测组分分离效果最好。

2.2 标准曲线 由图2可知，高效液相色谱-示差检测器法测定甜菜碱含量具有良好的线性关系，高效液相色谱-示差检测器法测定甜菜碱的回归方程为：y=108284x-23952，R2=0.9994。

2.3 精密度和回收率 在选定的条件下，对1份甜菜碱含量为10.00mg/mL的样品进行加标测定，甜菜碱标准溶液添加量分别为2.00mg/mL、4.00mg/mL、6.00mg/mL，每份实际样品分别进行5次重复测定，计算甜菜碱的相对标准偏差和回收率，测定结果见表1。

标准偏差越小，说明采用高效液相色谱-示差检测器测定甜菜碱数据的偏离平均值就越少，稳定性，重复性越高。由表1可以看出，所测结果与理论值偏差较小，标准偏差最大值为0.29%，回收率接近100%，说明采用高效液相色谱-示差检测器测定甜菜碱含量稳定性、精密度和准确度较高，完全能够满足试验要求。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-示差检测器测定甜菜碱含量的方法。试验结果表明，选用Supersil SCX 5μm阳离子交换柱测定甜菜碱，重现性好，精确度高，操作简单快捷，成本低，适用于甜菜碱的测定。该色谱方法基线平稳，峰形、线性关系良好，回收率及标准差平均值分别为100.18%和0.20%。而高氯酸滴定法、紫外光谱法[12，13]对甜菜碱含量测定的回收率和标准差都大于高效液相色谱-示差检测器测定，离子色谱法、超高效液相色谱-质谱联仪法，虽然精密度和稳定性高，但设备昂贵，对操作人员技术要求高。因此，采用高效液相色谱-示差检测器测定方法，是测定饲料、植物等中甜菜碱含量的理想方法，并能够有效进行质量控制。

参考文献

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（责编：王慧晴）