超高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定饲料中8种类固醇激素

房克艳,赵超敏,陈 沁,邓晓军

(1.上海大学生命科学学院,上海200444; 2.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心,上海 200135)

雄性激素和孕激素都是具有调节机体代谢或生理功能的类固醇激素,可促进动物生长,促进蛋白质合成,提高蛋白转化率。20世纪50年代雄性激素和孕激素被广泛用作动物生长促进剂,以大幅度提高养殖业的经济效益。然而,在饲料中滥用激素会导致其在动物组织中积累,进而通过食物链进入到人体内,干扰人体内自然的激素平衡。勃地酮、甲睾酮等雄激素会抑制女性雌激素水平,影响孕妇胎盘功能和胎儿的生长发育[1];影响糖和脂肪的正常代谢,导致肥胖、高血压等,促使心血管疾病和糖尿病的发生[2];甲羟孕酮乙酸酯、美仑孕酮等孕激素能够刺激机体合成其它代谢类固醇如雌二醇等激素[3],进而扰乱人体内分泌系统,导致女性性早熟、男性生育能力下降等严重后果[4-5]。因此,包括中国在内的许多国家禁止了睾酮及其代谢酯、盐类的使用[6],禁止其作为动物生长促进剂[7-8]。我国农业部第176号公告也明确指出禁止使用此类激素[9]。但是在利益的驱使下,违规用药的案例仍时有发生。因此,建立一种快速简单的类固醇激素多残留分析方法具有重要的实际意义。

目前,对于雄激素和孕激素的检测研究已经有很多,检测对象多为动物性产品[10-11]、环境基质[12]等,检测方法主要有气相色谱-串联质谱法(GC-MS)[12]、液相色谱法[13]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[14]和超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[15]。GC-MS分析样品时必须经过气化,检测雄激素和孕激素此类难挥发的物质时需要衍生化,操作繁琐、耗时长 。UPLC-MS/MS的方法灵敏度高,特异性强,常用于复杂基质中化合物的定性和定量检测[16]。饲料前处理方法主要有:液-液萃取法(LLE)[12]、基质固相分散萃取法(MSPD)[17]、固相萃取法(SPE)[18]、QuEChERS[19]等,相对于其它方法,LLE法的成本低且操作简单,是提取和分离的常用方法。本文利用LLE技术、UPLC-MS/MS技术,建立了饲料中8种类固醇激素的检测方法,以期实现大批量饲料样品的快速处理和检测,节省成本,提高检测效率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

勃地酮(BND,纯度98.8%)、17α-羟基孕酮(17α-OHP,纯度99.4%)、甲睾酮(MTS,纯度97.70%)、甲羟孕酮乙酸酯(MPA,纯度99.0%)、乙酸甲地孕酮(MEGA,纯度99.0%)、诺龙(NDL,纯度98.1%)、群勃龙(TB,纯度99.1%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司;美仑孕酮(MGA,纯度98%) 加拿大TRC公司;17α-羟基孕酮-D8(17α-OHP-D8,纯度99%) 加拿大CDN isotopes公司;睾酮-D3(TS-D3,纯度98.68%) 美国Sigma-aldrich公司;甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈和正己烷 HPLC级,美国TEDIA公司;乙酸铵、三氯乙酸、氯化镁、氯化锌和氢氧化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;超纯水 由Mili-Q超纯水系统制得;Athena C18-WP色谱柱 上海安谱科学仪器有限公司;饲料样品(单一植物源性饲料、饲料添加剂、浓缩饲料配合饲料和精料补充料) 均购自当地市场。

超高效液相色谱配QTRAP6500质谱 美国AB Sciex公司;IKARRVORTEX 2漩涡振荡器 德国Heidolph公司;CM-1000往复式振荡器 日本Yamato公司;Rotavapor R-215全自动氮吹仪 美国Caliper公司;RE601旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司;Allegra X-30R Centrifuge低温离心机 美国Sigma公司;Pipet-Lite XLS移液器 法国Gilson公司;BRANSON-2800超声清洗机 美国BRANSON公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 储备液:分别准确称取BND、17α-OHP、MTS、MPA、MEGA、NDL、TB和MGA 8种类固醇激素及其内标(17α-OHP-D8和TS-D3)各1.00 mg(精确到0.01 mg),以甲醇配制成浓度为100.0 mg/L的单标溶液,密封,于棕色瓶中-30 ℃储存。单标中间工作液:分别移取0.1 mL 100.0 mg/L的单标储备液,以甲醇配制浓度为1.0 mg/L的单标中间工作液,密封,于棕色瓶中-30 ℃储存,备用。混合标准工作液:使用前分别移取一定量1.0 mg/L的8种类固醇激素的单标中间工作液,用甲醇配制为100.0 μg/L的混合标准溶液(BND、17α-OHP、MTS、MPA、MEGA、NDL、TB和MGA),密封,于棕色瓶中-4 ℃储存。

1.2.2 仪器分析条件 色谱条件:色谱柱为Athena C18-WP色谱柱(2.1 mm×150 mm,5 μm);流速为0.40 mL/min;进样体积10 μL;流动相A为5 mmol/L乙酸铵(1‰甲酸),B为乙腈(1‰甲酸);洗脱程序:0～4 min,35%～50%B;4.0～8 min,50%～85% B;8～9 min,85% B;9～9.1 min,85%～35% B;9.1～14 min,35% B。质谱条件:电离模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+);多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS):5500 V;雾化气压力(GS1):55 V;气帘气压力(CUR):35 V;辅助气流速度(GS2):60 V;离子源温度500 ℃;碰撞气(CAD):Medium;入口电压(EP):10 V;所有气体由氮气提供(纯度,99.999%),具体参数见表1。

表1 8种类固醇激素及其及内标的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters for 8 steroid hormones and internal standards

1.2.3 样品前处理 称取5.00 g(精确到0.01 g)均质饲料样品,准确加入100 μL 100.0 μg/L睾酮-D3和17α-羟孕酮-D8内标。加入一定量的乙腈、10%三氯乙酸,涡旋30 s,超声提取10 min,4500 r/min离心5 min,取上清液于250 mL梨型瓶中。10 mL乙腈重复提取一次,合并提取液,于50 ℃旋转蒸发至近干。15 mL正己烷溶解残余物,加入一定量的0.1 mol/L氢氧化钠溶液、0.1 mol/L氯化镁,提取溶液于10000 r/min,5 ℃离心3 min,取上清液于试管中,10 mL正己烷重复提取一次,合并的提取液在低于40 ℃下,用缓和氮气流吹干。加入1 mL乙腈-水(1∶1,V/V)溶解残渣,加1 mL乙腈饱和正己烷溶液,涡旋混匀30 s,转移至2 mL连盖塑料离心管中,于4 ℃15000 r/min离心3 min,取下层溶液过0.22 μm滤膜,待测定。

1.2.4 方法优化 质谱条件:质谱的离子源温度、气帘气压力、雾化气压力、辅助气压力均在所有目标化合物都有良好响应信号的情况下进行优化。采用100.0 μg/L的单标准溶液流动注射泵连续进样方式,分别在正、负离子模式下进行一级(Q1)质谱全扫描(100～500 m/z),以确定准分子离子(母离子)。

色谱条件:选取Athena C18-WP色谱柱,在相同质谱条件下,流动相选择水-乙腈、水-甲醇和5 mmol/L乙酸铵水-乙腈(1‰甲酸),选择响应值高,峰形对称尖锐的流动相。另外,优化流速以及洗脱梯度,选择响应值高,耗时短,基质干扰低的流速和洗脱条件。

前处理条件:在饲料空白样品中添加8种类固醇激素混合标准溶液和两种内标物各1.0 μg/kg,按照1.2.3的方法进行处理。分别考察乙腈(ACN)、乙酸乙酯(EA)和甲醇(MeOH)的提取效果并确定最佳提取溶剂的体积;选取10%的三氯乙酸(TCA)和NaOH(0.1 mol/L)溶液作为除蛋白溶剂,根据其除蛋白效果和添加回收率结果确定其添加量;比较0.1 mol/L MgCl2和0.1 mol/L ZnCl2除脂效果,选取合适的除脂溶剂和添加体积。

1.2.5 方法学考察 考察所建方法的线性范围、检测限、定量限、回收率、精密度、基质效应等指标,以评价该方法的灵敏度、回收率、精密度和基质效应。

线性范围、检测限和定量限:配制一定系列标准曲线(0、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L),分别加入1.0 μg/L定量内标,以得到目标物质的峰面积与加入内标物质峰面积的比值为纵坐标(y),对应目标物质浓度与内标物质浓度的比值为横坐标(x),绘制工作曲线。以3倍基线噪声(S/N)所对应的待测物浓度为该方法的检测限(LOD),以10倍基线噪声(S/N)所对应的待测物浓度为该方法的定量限(LOQ)。

回收率和精密度:单一植物源饲料、饲料添加剂、浓缩饲料、配合饲料和精料补充料空白样品,分别添加1.0、2.0、5.0 μg/kg标准物质,按照1.2.2和1.2.3的方法进行检测分析(n=6),验证方法的回收率和精密度。

基质效应:选取空白基质(5种饲料样品)按照1.2.3的前处理方法进行处理,得到空白基质样品与乙腈/水(1∶1,V/V)分别配制一定系列内标标准曲线(0、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L),其中内标的添加量均为1.0 μg/L(n=3),得到8种类固醇激素空白基质匹配标准曲线斜率(k1)与乙腈/水(1∶1,V/V)配置标准曲线斜率(k2)。根据以下公式,计算8种类固醇激素的基质效应值(Matrix effect,ME):

ME=0没有基质效应;ME>0离子增强作用;ME<0离子抑制作用。

1.2.6 实际样品的检测 按照1.2.2和1.2.3的方法对从市场采购的5种饲料样品(每种类型各10份)进行检测。

1.3 数据统计分析

数据采集和处理利用Analyst1.5.2软件进行。8种类固醇激素均采用内标法进行定量分析,具体定量情况见表1。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

8种类固醇激素在正离子模式,且[M+H]+作为母离子时质谱响应值最高。因此,选择正离子模式进行电离。去簇电压(Decluster potential,DP)是影响离子响应值的重要质谱参数。因此,首先优化DP使每一个母离子获得最大灵敏度,进一步优化其它色谱参数。以母离子为准分子离子进行二级质谱扫描,子离子在以氮气为碰撞气的碰撞室内获得,选择丰度较高的两个特征离子碎片作为定量和定性离子(图1)。

图1 8种类固醇激素及其内标的二级质谱图Fig.1 Secondary mass spectrogram of 8 steriod hormones and their internal standards

2.2 色谱条件的优化

根据8种类固醇激素的化学结构,选择3组流动相进行比较,水-乙腈作为流动相时,8种类固醇激素的响应值高,且在流动相中加入甲酸,更有利于其离子化,提高其响应值;乙酸铵的加入,可维持流动相pH的稳定,减少次级保留,改善峰形,使峰形更加对称尖锐,提高积分的准确度。因此,选择5 mmol/L乙酸铵水-乙腈(1‰甲酸)为流动相。图2为经梯度洗脱的二级质谱提取离子流图。另外,对比了流速为0.20、0.30、0.40、0.50 mL/min时的分离效果,流速过低时,出峰时间晚,耗时;流速为0.50 mL/min时,出峰时间早,基质影响大。最终确定流速为0.40 mL/min,此时出峰时间集中在4～8 min,且基质影响效果小。

图2 8种类固醇激素及其内标的二级质谱提取离子流图(1.0 μg/kg)Fig.2 MS/MS extraction ion spectra of 8 steroid hormones and two internal standards(1.0 μg/kg)

2.3 提取条件的选择

2.3.1 提取溶剂的选择 由于8种类固醇激素在弱极性和中等极性的溶剂中均具有良好的溶解性。选取的3种提取溶剂在体积(均为20 mL)与前处理条件均相同的情况下,三者的提取回收率分别在70.6%～99.1%、38.3%～84.5%和31.4%～94.0%之间。乙腈对8种激素的提取效果均良好,甲醇对勃地酮、群勃龙、甲羟孕酮乙酸酯和乙酸甲地孕酮的提取效果不理想,而乙酸乙酯的提取效果均不理想(图3);且甲醇提取液暴露在空气中一段时间后,颜色由黄色变为草绿色,后期的净化处理无法将其有效去除,而乙腈和乙酸乙酯提取液颜色为浅黄色,进一步纯化后,色素能够被去除;经甲醇提取的样品,质谱响应值低,且峰形乱,表明提取液中基质共提物较多。考虑到回收率、基质效应和提取效率等综合效果,最终选择乙腈作为提取溶剂。

图3 提取溶剂的种类对8种类固醇激素回收率的影响Fig.3 Effect of type of extraction solvent on 8 steroid hormones

2.3.2 提取溶剂体积的选择 对比了10、15、20、25 mL的提取溶剂对回收率的影响,结果显示,当提取剂体积为10 mL时,除甲睾酮和诺龙外,其它6种激素的提取率在45%～70%之间,且峰形宽,色谱响应值低;当提取剂体积为15 mL时,回收率均达到70%以上,峰形明显改善,继续增加提取溶剂的量,回收率有上升的趋势,但变化并不明显(图4)。为了节省有机溶剂和旋转蒸发的时间,选择提取溶剂体积为15 mL。

图4 提取溶剂体积对8种类固醇激素回收率的影响 Fig.4 Effect of volume of extraction solvent on 8 steroid hormones

2.4 净化条件的选择

2.4.1 除蛋白条件的选择 分别在均质饲料中加入600 μL(A组)、700 μL(B组)、800 μL(C组)10%的三氯乙酸(TCA)。结果显示:B组的提取液浑浊,呈现不透明状,而A组和C组的提取液较清澈;浓缩后,白色残余物的量为A>B>C;且A组样品:有杂质均匀的粘连在梨型瓶壁上,B、C组样品:大部分杂质均聚集在梨型瓶的底端。由于C组添加10% TCA的量多,蛋白迅速凝聚,部分分析物被包裹在内,造成分析物的损失;而B组样品则是在旋转蒸发的过程中缓慢的发生蛋白质的聚集,既能有效去除蛋白,又避免了分析物的大量损失。因此,选择添加700 μL 10% TCA。

为了进一步去除残余蛋白,选择添加一定量的NaOH(0.1 mol/L)。通过考察其添加量对类固醇激素回收率的影响,结果显示:随着NaOH添加量的增加,梨型瓶底部白色沉淀物的量逐渐增加,表明加入的NaOH溶液能够有效的分离出残留的蛋白。由图5A可以看出,NaOH(0.1 mol/L)添加量对4种雄激素的影响较大,对4种孕激素回收率影响效果不明显。NaOH添加量为0～1 mL时,受样品中蛋白质的干扰,雄激素的回收率低,质谱峰宽且拖尾,导致积分不准确;添加量为2 mL时,提取液呈现不透明状,说明大部分蛋白质已经被沉淀出,且此时各激素的回收率及色谱峰形均良好;继续增加NaOH添加量,回收率效果变化不明显。因此,选择NaOH(0.1 mol/L)的添加量为2 mL。

图5 NaOH(0.1 mol/L)添加量 对8种类固醇激素收率的影响Fig.5 Effect of NaOH(0.1 mol/L) addition on 8 steroid hormones

2.4.2 脱脂条件的选择 通过比较0.1 mol/L MgCl2和0.1 mol/L ZnCl2的除脂效果,结果显示,两者均具有除脂效果,相比较而言,经MgCl2除脂后,8种类固醇激素的回收率高(图6)。表明,MgCl2能有效降低基质的影响,提高回收率。因此,选择MgCl2作为除脂溶剂。

图6 MgCl2与ZnCl2对8种类固醇激素回收率影响效果的比较Fig.6 Comparison of effects of MgCl2 and ZnCl2 on 8 steroid hormones

MgCl2(0.1 mol/L)添加量不仅影响除脂效果,而且会对目标物产生一定的基质干扰。对比结果显示,对于雄激素,不添加MgCl2时,群勃龙的回收率较低,为60%左右;随着MgCl2添加量的增加,诺龙的回收率逐渐增加(图7A);对于孕激素,美仑孕酮和乙酸甲地孕酮的响应值随着MgCl2添加量的增加而略有降低,但回收率均在70%以上,对其它几种激素的回收率影响效果不明显(图7)。因此,选择MgCl2(0.1 mol/L)添加量1 mL。

图7 MgCl2(0.1 mol/L)添加量对8种类固醇激素回收率的影响Fig.7 Effect of MgCl2(0.1 mol/L) addition on 8 steroid hormones

以上分析可以看出,4种雄激素受蛋白质和脂肪的影响较大,4种孕激素受其影响相对较小。蛋白质和脂肪的去除,不仅能够减少基质的干扰,使检测结果更为准确;更重要的是,能够减少对仪器的损伤,避免长期检测在仪器中积累大量的蛋白质和脂肪,堵塞管路、色谱柱,减少仪器的使用寿命。

2.5 基质效应

通过比较基质匹配内标标准曲线的斜率与乙腈/水(1∶1,V/V)溶剂内标标准曲线的斜率。结果显示:8种类固醇激素的ME(%)值均小于10%,且5种空白基质匹配内标标准曲线定量分析的结果与用乙腈/水(1∶1,V/V)配制的内标标准曲线定量分析的结果差别不大(以甲睾酮为例-图8)。表明样品基质中存在一定的基质效应,但是对分析结果的影响效果不大。

图8 液相色谱-串联质谱的基质效应考察(甲睾酮为例)Fig.8 Matrix effect of LC-MS/MS(methyltestosterone as an example)

2.6 方法学考察

2.6.1 方法线性范围、检出限和定量限 该方法的线性相关系数均在0.999以上,线性关系良好。3倍基线噪声(S/N)所对应的待测物浓度LOD为0.10～0.34 μg/kg,10倍基线噪声(S/N)所对应的待测物浓度LOQ为0.35～0.98 μg/kg,与其它检测方法相比,该方法的检出限和检测限低[20-21],表明该方法的灵敏度高。

2.6.2 方法回收率与精密度 单一植物源饲料、饲料添加剂、浓缩饲料、配合饲料和精料补充料空白样品,分别添加1.0、2.0、5.0 μg/kg标准物质,按照1.2.2和1.2.3的方法对加标样品进行处理和检测,每个水平平行测定6次,其加标回收率均在70.4%～109%之间,相对标准偏差(RSDs)为0.38%～10.3%(表3)。该方法准确度和精密度均符合饲料中激素残留检测的要求。

表3 8种类固醇激素的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Sampling recovery and relative standard deviation of 8 steroid hormones(n=6)

续表

2.7 实际样品分析

采用所建方法对从市场采集的5种饲料(每种类型10个样品)进行检测分析,均未检出上述8种激素。

3 结论

本文建立了饲料样品中4种雄性激素(勃地酮、甲睾酮、诺龙和群勃龙)和4种孕激素(甲羟孕酮乙酸酯、美仑孕酮、乙酸甲地孕酮和17α-羟基孕酮)的超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)方法。样品前处理采用液-液萃取的方法,操作简单,净化效果好,能有效地降低基质效应;可在14 min实现8种类固醇激素的检测分析,与普通的液相色谱方法相比,分离效果好,分析时间短,检出限和定量限低,精密度高;该方法的回收率和线性均符合检测的要求。该方法可靠、快速,灵敏度高,可作为饲料中8种类固醇激素的确证和定量方法。