超声波对花生粕蛋白功能特性及结构特性的影响

张艳艳 王冰蕊 张少可 李银丽 张 华

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院;食品生产与安全河南省协同创新中心;河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，郑州 450002)

花生蛋白在压榨提取花生油的过程中发生严重热变性，进而导致花生蛋白的营养价值降低，功能特性也降低，这极大地限制了花生粕在其他领域的应用，花生粕资源浪费严重。植物蛋白的功能特性是指蛋白质本身具有能影响食品质量的物理性质和化学性质。主要包括起泡性、乳化性、持水性、吸油性、溶解性等。这些特性除了与氨基酸组成、分子大小和结构形态等属性有关外，还与蛋白质相互作用的组分和其所在环境等有关。物理改性是指改变蛋白分子间的聚集方式和蛋白质的高级结构。这种方法具有无毒，可接受性高的特点，因此更广泛的被应用到食品领域。

超声波是一种快速无损的物理加工方法，超声波的空化作用，机械作用及定向作用可有效增强物料的传质传热，加速其化学反应的进行。Zhang等[1]研究发现超声波处理后，花生分离蛋白的乳化性得到了明显的改善，并且蛋白分子的平均直径由474.70 nm减少到255.80 nm。超声波处理可尽量减少花生蛋白三级空间结构的变化。邵悦等[2]研究了不同超声波处理时间和对花生蛋白功能特性的影响，研究发现，不同的超声波处理时间对花生蛋白的功能影响效果不同，超声波处理5～20 min后，花生蛋白的起泡性、泡沫稳定性、乳化性、吸油性和溶剂性都得到了一定的改善。

研究证实，超声波的作用效果与其工作模式直接相关，不同工作模式的超声波对物料的结构的影响具有较大差异[3, 4]。

本研究以热榨花生粕为主要原料，研究了探头式、平板式、平板式协同探头式超声波对花生粕蛋白功能特性的影响，并对其蛋白结构进行表征，以期揭示不同模式超声波对花生粕蛋白功能特性的改良机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

热榨花生粕：周口鲁花浓香花生油有限公司；金龙鱼大豆植物油：上海嘉里食品工业有限公司；三羟甲基氨基甲烷；甘氨酸；乙二胺四乙酸；5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)；8-苯胺-1-萘磺酸：麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯或优级纯。

1.2 花生粕蛋白的制备及多模式超声波的处理

1.3 花生粕蛋白功能特性的测定

1.3.1 花生粕蛋白起泡性及泡沫稳定性测定

根据马勇等[6]的方法进行。根据式(1)计算花生粕蛋白的起泡性，再根据式(2)计算其泡沫稳定性。

(1)

(2)

1.3.2 花生粕蛋白的乳化性及乳化稳定性测定

参考李维遥等[7]的方法进行，取20 mL的蛋白溶液倒入烧杯中,再加入等体积的20 mL大豆植物油混匀。均质2 min,转速为10 000 r/min,取20 mL于50 mL离心管中，配平后进行离心，离心力设定为1 750 g,离心时间设定为5 min。借助直尺进行读数，并记录液体总高度和乳化层高度。再将测量后的离心管放置在60 ℃的水浴锅中，恒温放置30 min后取出，待冷却至室温后，再次进行离心，离心力设定为1 750 g,离心时间设定为5 min,最后再借助直尺测量离心管中乳化层的高度。根据式(3)计算花生粕蛋白的乳化性，再根据式(4)计算乳化稳定性。

(3)

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(4)

1.3.3 花生粕蛋白的溶解性、吸油性和持水性的测定

参考文献[2]中的方法进行。

1.4 花生粕蛋白结构特性的测定

1.4.1 紫外光谱和荧光光谱的扫描

将200 mg花生粕蛋白粉溶解在15 mL的磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L, pH为7.0)中离心(4 670 g)10 min，离心后弃去沉淀。取0.5 mL的蛋白上清液稀释至12倍，用紫外分光光度对其进行光谱扫描[8]。紫外扫描参数为：扫描范围200～400 nm，扫描速度 60 nm/min，光程 1.0 cm，狭缝宽度0.2 nm。荧光扫描参数为：激发波长290 nm，扫描范围：300～400 nm，扫描速度240 nm/min，激发和发射的狭缝宽度5 nm[9]。

1.4.2 红外光谱扫描及二级结构的测定

准确称量0.002 g的花生粕蛋白粉样品，加入KBr 0.018 g，充分混匀后用研钵将混合物研磨成粉末，将混合粉末压制成薄片。利用傅里叶红外光谱扫描仪，对压制好的薄片进行波段扫描，波段扫描的范围设定在4 000～400 cm-1，扫描次数设定为32。每个样品做3次平行试验[10]。在1 600～1 700对蛋白二级结构单元含量的分析参照[11]等的方法。

1.4.3 花生粕蛋白的巯基含量测定

取200 mg花生粕蛋白粉于50 mL的离心管中，倒入15 mL的Tris-Gly缓冲液(0.086 mol/L Tris，0.090 mol/L Gly，4 mmol/L EDTA，pH 8.0)，漩涡震荡提取30 min,然后进行离心，离心力设定为5 836 g,离心时间设定为20 min，离心后取上清液1 mL加入表面包有避光材料的10 mL的离心管中，再加入5 mL由8 mol/L的尿素和0.5%的EDTA(用Tris-Gly缓冲液配制)配制的溶液，最后加入50 uL的Ellman’s试剂(由4 mg的DTNB试剂溶于1 mL的Tris-Gly缓冲液配制成的Ellman’s试剂)，充分摇匀，至于30 ℃水浴锅中反应1 h,用分光光度计在412 nm处测定吸光度值。根据吸光度值计算出巯基含量[12]。根据式(5)计算巯基含量。

(5)

1.5 热特性的检测

参照Meng等[13]的方法进行。

1.6 数据分析

数据分析采用Origin 8.5、PeakFit v4.12、及Excel等软件。

2 结果与分析

2.1 超声波对花生粕蛋白功能性特性的影响

由表1所示，不同工作模式的超声波处理后，花生粕蛋白各项功能特性发生了显著变化。对于蛋白的起泡性，乳化性和持油性，效果最优的是平板+探头式超声波。与对照样品相比分别增高了15.0%、62.9%和7.0%。对于蛋白的泡沫稳定性、乳化稳定性、溶解性和持油性，效果最好的探头式超声波。与对照样品相比分别增高了8.1%、24.3%、5.1%、23.8%。

表1 超声波对花生粕蛋白功能特性的影响

注：同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。

不同的超声波作用方式，对蛋白不同的结构单元影响会不同，造成了功能特性也会有不同的变化。平板式超声波作用均匀，但是其在物料分子之间的穿透力度不够。探头式超声波穿透能力强，但是其波形是自上而下的驻波，作用范围有限且分布不均。对于蛋白的溶解性，探头式超声波作用力集中，使蛋白颗粒破裂，粒径变小，表面积增大，有利于维持原来有序结构的次级键打开，溶解度提高。对于蛋白的乳化性，蛋白分子更容易在均匀超声场的诱导下产生极化现象，使维持蛋白空间结构的非共价键(疏水相互作用、二硫键、静电相互作用)被破坏，蛋白分子部分展开，分子的柔性提高，更多的蛋白分子结合到油-水界面[14,15]。同时，蛋白分子内部的疏水残基暴露在蛋白表面，蛋白表面的疏水性增强，故蛋白的乳化活性增强，因此平板式+探头式超声波优势更为明显。

2.2 超声波对花生粕蛋白结构特性的影响

天然的花生蛋白具有较好的起泡性、乳化性、吸油性、持水性和溶解性等功能特性，花生粕蛋白功能特性劣变的主要原因为高温压榨时花生蛋白质发生了热变性。为了揭示超声波对花生粕蛋白功能特性的改良机制，分别研究了不同超声波工作模式对花生粕蛋白紫外、荧光光谱特性、蛋白二级结构、巯基含量和表面疏水性的影响。

2.2.1 紫外光谱和荧光光谱

由图1a可以看出，经过超声波处理后，紫外最大吸收波长发生了蓝移。这是因为经过超声波处理后，花生粕蛋白质子解聚展开产生了新的亚基，从而使得紫外最大吸收波长发生了蓝移。同时也能够表明多模式超声波处理后，花生粕蛋白分子的展开程度变大，分子表面具有紫外吸收的残基可能增多。对于花生粕蛋白的紫外光谱特性，改变最大的是探头式超声波。由图1b可以看出，经过多模式超声波处理后，花生粕蛋白的荧光最大吸收峰位发生了显著性的偏移。与对照组相比，探头式超声波处理的花生粕蛋白的荧光最大吸收峰偏移最显著。最大吸收峰位红移表明分子结构的展开，同时展现为分子内部色氨酸残基的逐渐暴露[16]。实验数据显示，多模式超声波处理后的花生粕蛋白的峰位在红移，表明花生粕蛋白的结构在不断展开，分子内部的色氨酸残基在逐渐暴露。这说明超声波会导致花生粕蛋白的聚集和结构的变化，且探头是超声波的作用效果最为显著。

图1 超声波对花生粕蛋白紫外光谱和荧光光谱的影响

2.2.2 巯基含量

由图2所示，多模式超声波处理后的花生粕蛋白的巯基含量发生了明显的变化。其中，改善效果最好的是平板式超声波，增高了20.3%。探头式超声波对其影响不大。平板+探头式超声波处理后，巯基含量下降，与对照组相比，下降了8.5%。经过一定方式处理后，蛋白质分子结构会发生伸展变性，继而引起二硫键含量和巯基含量的变化。巯基含量的上升就是因为蛋白结构改变，而蛋白内部结构展开使得内部巯基暴露，蛋白的亚基发生解离和二硫键断裂生成巯基，这些都有可能带来这种改变。巯基含量降低是因为巯基氧化、SH和S-S交换导致二硫键的形成[17]。因此，平板式超声波可能导致花生粕蛋白内部结构展开，从而使内部巯基暴露，使得总巯基含量变高；而平板+探头式超声波可能导致巯基和二硫键之间形成了交换，使得巯基向二硫键转变，导致总巯基含量降低。

图2 超声波对花生粕蛋白巯基含量的影响

2.2.3 蛋白二级结构

本次实验利用多模式超声波对花生粕蛋白进行处理，通过傅里叶红外扫描仪对样品进行4000～400 nm波段扫描，得到了红外吸收光谱图如图3。对其酰胺Ⅰ带进行分峰拟合之后得到表4。

表2所示，超声波处理显著改变了花生粕蛋白的二级结构。对于α-螺旋、β-转角和β-折叠，平板+探头式和探头式超声波对其相对百分含量影响效果最为显著，但两者之间并无显著差别。对于无规则卷曲结构，三种模式的超声波处理并无显著差别。花生粕蛋白中的α-螺旋结构和β-转角结构的相对百分含量有明显的上升，而β-折叠结构和无规则卷曲结构的相对百分含量在下降。超声波造成β-折叠结构的氢键断裂和无规则卷曲结构的聚集结构解离，导致两者百分含量下降，进而转化为α-螺旋结构和β-转角结构，造成后两者百分含量上升[19]。

表2 超声波对花生粕蛋白中二级结构的影响

图3 红外光谱图

2.3 超声波对花生粕蛋白热力学特性的影响

在表3中，Td是蛋白质热稳定性的代表，Td值越大，代表蛋白热稳定性越高，经过平板式超声波处理后的花生粕蛋白的Td值最大，因此其热稳定性最好。ΔH代表焓变，反映热变性程度，ΔH值越小，热变性程度越低。平板+探头式超声波处理后的花生粕蛋白的ΔH最小，其热变性程度最低，与对照样品相比，降低了8.6%。ΔH还能反映蛋白质的疏水性，同时也反映的是蛋白质分子的聚集程度，ΔH越高，代表疏水性越小，聚集程度越大。可知，平板+探头式超声波处理的花生粕蛋白的疏水性变大。在表5中还有两个参数就是Ta初始温度，Tc终止温度，这两者的差值代表着峰的宽窄。峰的宽窄可用来说明变性转变的协同性，峰越窄，说明协同性越高[20-22]。可知，三种超声波模式中，平板式超声波处理后的花生粕蛋白的Tc-Ta值最小，说明平板式超声波处理后的花生粕蛋白的协同性最高。

图4 DSC谱图

工作模式Ta/ ℃Tc/ ℃Tc-Ta/ ℃Td/ ℃ΔH/J/g对照142.28182.7740.49146.14643.10平板151.92195.5942.67162.59641.94探头144.45195.3250.87148.55658.26平板+探头145.95194.5248.57159.20588.03

注：Ta是初始温度，Tc为终止温度，Td为峰值温度，ΔH为变性焓值。

3 结论

本文研究了探头式、平板式和平板协同探头式超声波处理对花生粕蛋白功能特性及蛋白结构的影响。结果显示，超声波可以显著改善花生粕蛋白的功能特性。对于蛋白的起泡性，乳化性和持油性，效果最优的是平板+探头式超声波，与对照样品相比分别增高了15.0%、62.9%和7.0%。对于蛋白的泡沫稳定性、乳化稳定性、溶解性和持油性，效果最好的探头式超声波。与对照样品相比分别增高了8.1%、24.3%、5.1%和23.8%。超声波处理后，花生粕蛋白的分子结构有明显的改变。紫外光谱结果表明：超声对花生粕蛋白分子构象有改变，紫外最大吸收波长发生了蓝移，荧光最大吸收峰明显的指示峰位在红移，蛋白的结构在不断展开，分子内部的色氨酸残基逐渐暴露，超声波导致花生粕蛋白的聚集和结构的变化。探头式、平板+探头式超声波对α-螺旋、β-转角和β-折叠的相对百分含量的影响最大，但两者无显著差别；平板式超声波显著提高了花生粕蛋白的巯基含量，与对照样品相比提高了20.6%；热力学特性的结果显示，探头式超声波处理后的焓变最小，与对照样品相比下降了8.6%。超声波处理通过改变花生粕蛋白的分子结构改善其功能特性，降低其热变形的程度。