分散固相萃取结合气相串联质谱法检测黑胡椒中19种农药残留

吴南村 张群 李春丽 刘春华 乐渊 吴学进

摘要：【目的】建立分散固相萃取结合气相串联质谱法测定黑胡椒中敌敌畏、联苯菊酯、氯氰菊酯等19种农药残留的方法，为黑胡椒产品的多种农药残留同时检测提供技术支持。【方法】黑胡椒样品采用乙腈提取，提取液经吸附剂净化后过膜上机，由HP-5MS色谱柱分离，在电喷雾离子源的多反应监测模式下对19种农药进行检测。通过正交试验优化无水硫酸镁、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和C18 4种吸附剂的配比。【结果】100 mg无水硫酸镁+20 mg PSA+50 mg GCB+40 mg C18为最佳配比的混合吸附剂;19种农药采用外标法定量;基质标准溶液在0.004～1.00 mg/L范围内线性关系良好（R>0.9900）;53%农药为强基质效应，其中大部分为有机磷类农药，42%为中等基质效应;样品在3个不同添加水平下回收率为76.0%～114.0%，相对标准偏差（RSD）（n=3）在2.0%～12.0%，均小于15.0%，苯醚甲环唑检出限为0.010 mg/kg，其余农药检出限为0.007 mg/kg。【结论】建立的分散固相萃取结合气相串联质谱法前处理简单快速，准确度和精密度符合检测要求，适用于黑胡椒中敌敌畏等19种农药残留的同时检测。

关键词： 黑胡椒;农药残留;分散固相萃取;气相串联质谱

中图分类号： S132                      文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0656-06

0 引言

【研究意义】黑胡椒是世界著名的香辛料，其贸易历史悠久。我国是黑胡椒的主要进出口国之一（丁黄山，2017;郑维全等，2017）。农产品进出口贸易中常需要进行农药残留检测，各国对农药残留限量也均有要求，目前我国GB 2763—2016标准中胡椒的最大残留限量（MRL）农药有阿维菌素、咪鲜胺和咪鲜胺锰盐;国际食品法典中胡椒的残留限量农药有咪鲜胺和啶虫脒（Codex Alimentarius，2017）;欧盟的胡椒农药残留限量约有400种（European Commission，2017），美国仅对敌敌畏农药残留有限量（Bryant Christie Inc，2018），加拿大对胡椒限量的农药有哒螨灵等20多种（Goverment of Canada，2019）。我国的种植技术标准DB 46/T 260—2013中规定胡椒使用的农药有阿维菌素、咪鲜胺、毒死蜱、氯氟氰菊酯、多菌灵等多种常用农药。鉴于进出口贸易和胡椒质量安全检测的需要，有必要开发胡椒中农药残留检测方法。【前人研究进展】已有研究表明，采用气相色谱法FPD检测器可完成胡椒中有机磷农药残留的准确定量（尹桂豪等，2003）;印度尼西亚的种植园常使用有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药，对少量胡椒样品的高效氯氟氰菊酯和倍硫磷检测结果表现为部分检出且检出值均低于国际食品法典委员会（CAC）和日本的MRL（Wiratno et al.，2007）;采用硅胶柱净化、气相色谱ECD检测器可实现白胡椒和黑胡椒中16种有机氯和拟除虫菊酯农药残留的准确定量（Chai and Elie，2013）;胡椒中的阿维菌素可用高效液相色谱荧光法测定（张月和徐志，2013）;采用QuEChERS方法提取，HLB柱进行净化及超高壓离子肼液相质谱法能完成黑胡椒中199种农药的筛查和定量（Goon et al.，2018）;采用QuEChERS结合d-SPE提取和净化，LCMSMS为检测仪器，能够完成黑胡椒中34种农药的检测（Yao et al.，2019）。这些方法有效定量或定性了胡椒的农药残留，但当前国内外胡椒农药残留的检测研究仍相对较少。【本研究切入点】分散固相萃取方法目前已广泛应用于蔬菜、水果等植物样品的农药残留检测前处理中（郭虹等，2018;廖艳华等，2018;田甜等，2018;张延平等，2018），但尚未见国内利用该方法检测胡椒样品农药残留的相关研究报道。本研究基于固相分散萃取和气相串联质谱技术开发胡椒种植中常用的敌敌畏、氯氟氰菊酯等19种农药的检测方法。【拟解决的关键问题】采用无水硫酸镁、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和C18混合净化，通过正交试验考察各吸附剂用量，通过回收率和色素去除效果指标优化出最佳用量，开发一种简单高效的黑胡椒中敌敌畏、氯氟氰菊酯等19种农药残留的检测方法，为黑胡椒产品的多种农药残留同时检测提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

新鲜胡椒浆果晒干制成黑胡椒粒，经搅拌机粉碎后过20目筛，装入密封袋中置于干燥环境备用。敌敌畏、联苯菊酯、氯氰菊酯等19种农药标准品（1000 mg/L）购自农业农村部天津环境质量监督检验测试中心，乙腈和丙酮（色谱纯）购自美国飞世尔公司，PSA、GCB和C18粉末购自美国安捷伦公司，无水硫酸镁购自广州化学试剂厂。主要仪器设备：0.22 μm尼龙有机相针式滤器（上海安谱实验科技股份有限公司）、梅特勒AB-204N型电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]、Agilent7890A/7000A气相串极质谱仪（美国安捷伦公司）、LXJ-ⅡB离心机（上海安亭科学仪器厂）、多管涡旋混合器（北京优晟联合科技有限公司）、XW-80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）、HR2056搅拌机[飞利浦（中国）投资有限公司]。

1. 2 标准溶液配制

混合储备液：19种农药标准品先用丙酮稀释为100 mg/L混标储备液，再用丙酮或乙腈等溶剂稀释成1和10 mg/L等浓度的混标储备液，置于-18 ℃下避光保存。

基质标准溶液：提取和净化不含目标化合物的空白样品并蒸干，用1 mL不同浓度溶剂配制的标准溶液定容空白样品，得到基质标准溶液。

1. 3 样品前处理

称取2.00 g样品置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL乙腈，20000 r/min涡旋提取2 min，再以3000 r/min离心4 min，吸取上层有机相1 mL置于含有吸附剂和无水硫酸镁的离心管中，涡旋2 min后10000 r/min离心5 min，吸取上层清液过膜上机。

1. 4 正交试验设计

通过正交试验优化分散固相萃取吸附剂用量，设无水硫酸镁、PSA、GCB和C18 4个因素，各因素设3个水平，每个试验进行3个平行，共计27次试验，各因素水平和试验设计见表1。

1. 5 添加回收和基质效应试验

取不含待测农药的空白样品添加目标化合物并放置30 min，采用100 mg无水硫酸镁、20 mg PSA、50 mg GCB和40 mg C18配比的吸附剂进行净化处理，依照1.3进行。每个添加浓度设3个平行。

相同浓度的基质标准溶液和溶剂标准溶液分别进样3针，化合物的基质效应（ME）=基质标准平均响应值/溶剂标准平均响应值。ME=1.0表示不存在基质效应，0.8<ME<1.2为弱基质效应，0.5<ME<0.8或1.2<ME<1.5为中等基质效应，ME<0.5或ME>1.5为强基质效应（刘进玺等，2016）。

1. 6 分析条件

色谱条件：HP-5MS色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 µm），进样口温度260 ℃，进样量1 µL，不分流进样，进样口温度260 ℃;柱箱程序：升温至70 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至150 ℃保持3 min，再以15 ℃/min升至200 ℃保持3 min，以20 ℃/min升至280 ℃保持8 min。载气为99.999%氦气，流速1 mL/min，溶剂延迟4 min，碰撞气为99.999%氮气。

质谱条件：电子轰击源（EI）70 eV，连接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，碰撞气流速为氮气1.50 mL/min，氦气2.25 mL/min。各农药的保留时间、母离子、子离子、碰撞能量和去簇电压等参数见表2。

2 结果与分析

2. 1 分散固相萃取吸附剂用量的优化结果

通过考察回收率（70%～120%）和色素去除效果来优选分散固相萃取吸附剂用量，色素去除效果越好则上机液相对颜色越浅（中为颜色介于深和浅的中间值）。19种农药在约0.8 mg/kg添加水平下1～9号试验的平均回收率和上机液相对颜色结果见表3。从表3可知，单考虑添加回收率时，1、2、3和5号试验结果最理想;综合考虑添加回收率和色素去除效果，则以3和5号试验结果最理想。

对19种农药的添加回收结果进行极差分析，结果显示，氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、腐霉利、三唑酮、甲基异柳磷和三唑磷9种农药各因素的回收率极差均小于10%，表明这9种农药受各因素的影响较平均且对水平变化不敏感，而其余10种农药的回收率极差均大于10%，受不同水平无水硫酸镁的影响明显，且大部分农药在无水硫酸镁100 mg水平下回收率最佳;对于PSA而言，氟氯氰菊酯回收率极差为11%，且20 mg用量回收率最佳，其余农药PSA水平变化对回收率影响不明显;对于GCB而言，敌敌畏、马拉硫磷和哒螨灵回收率极差均大于10%，同时测定GCB最佳用量综合為50 mg;对于C18而言，甲拌磷、二嗪磷、哒螨灵和苯醚甲环唑回收率极差均大于10%，最佳C18用量多为20和40 mg。综合表3结果中的3和5号试验及极差分析优选出的方案为100 mg无水硫酸镁+20 mg PSA+50 mg GCB+40 mg C18，其验证试验结果表明，优选的方案用料更少且回收率满足要求，然后进一步完成添加回收试验。

2. 2 基质效应的评价结果

19种农药的基质效应见表4，其中53%的农药为强基质效应，大部分为有机磷类农药，有机氯类农药有腐霉利，菊酯类农药有氯氟氰菊酯和氰戊菊酯;42%为中等基质效应，包括三唑酮、联苯菊酯、三唑磷、哒螨灵等8种农药。为了消除基质效应影响和确保准确定量，需使用基质标准溶液。

2. 3 线性关系和检出限

以目标化合物浓度为横坐标、对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，各化合物的线性范围、线性方程和相关系数见表4;以最低添加浓度时样品的响应情况为基础，根据3倍信噪比计算检出限（表4）。总体而言，有机氯和菊酯类农药的响应值优于有机磷类农药;各农药的线性关系良好，相关系数均大于0.9900，其中氧乐果、三唑酮等13种农药的相关系数大于0.9990，占68%;除苯醚甲环唑外的各农药检出限相对较低，基本满足最大残留限量测定要求。

2. 4 准确度和精密度

由表5可看出，19种农药在3个不同添加浓度下的回收率均满足检测要求，回收率在76.0%～114.0%，相对标准偏差（RSD）（n=3）在2.0%～12.0%，均小于15.0%，说明该方法稳定性良好。

3 讨论

黑胡椒样品中含有色素、有机酸、胡椒碱、挥发油等成分，这些化合物均干扰农药残留的检测，其中油脂类干扰大且容易污染仪器。GCB能很好地去除色素，但同时会吸附农药，其用量需要考察。本研究结果表明，GCB去除黑胡椒样品的色素效果明显，上机液相对颜色与GCB用量呈正相关，100 mg用量时样品几乎无色。C18目前主要用于去除油脂（崔春艳等，2017;罗媛媛等，2018;宁霄等，2018），但60 mg C18用量对胡椒油脂的去除效果仍有限，多反应监测模式（MRM）下对19种农药的残留测定无明显影响。PSA能吸附有机酸、糖类和酯类等，正交试验极差分析结果表明，GCB、C18和PSA 3种吸附剂对不同农药回收率的影响各不相同，但在多种配比下仍能满足大部分农药的添加回收，故本研究优化后的方法可推广使用到性质相近的其他农药。

由于难以完全分离目标化合物和基质，所以农药残留检测中基质效应是一种普遍现象，一般受样品浓度、仪器类型、化合物性质和样品类型等多因素影响，质谱类仪器离子化过程容易受到基质干扰，基质效应通常较明显，本研究基质效应与其他报道一致，即气相质谱类仪器上有机磷类农药的基质效应普遍大于有机氯和菊酯类农药（易盛国等，2012），大部分有机磷、有机氯、菊酯类农药均表现为基质增强作用（马智玲等，2013），含油类、蛋白质类较多的样品基质效应更强（易盛国等，2012）。由于分散固相萃取方法净化效果有限，胡椒样品又含有精油等成分，因此大部分化合物表现为强基质效应。

4 结论

在正交试验基础上优化得到100 mg无水硫酸镁+20 mg PSA+50 mg GCB+40 mg C18混合配比的吸附剂能同时满足19种农药检测的回收率要求。分散固相萃取结合气相串联质谱法快速简便，可应用于黑胡椒产品敌敌畏等19种农药残留的同时检测。

参考文献：

崔春艳，张红医，吴兴强，范春林，李帅，陈辉，常巧英，庞国芳. 2017. 分散固相萃取—液相色谱—串联质谱法测定谷物、蔬菜、水果中27种新型杀菌剂[J]. 色谱，35（5）：487-494. [Cui C Y，Zhang H Y，Wu X Q，Fan C L，Li S，Chen H，Chang Q Y，Pang G F. 2017. Determination of 27 new fungicides in cereals，vegetables and fruits by dispersive solid phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography，35（5）：487-494.]

丁黄山. 2017. 越南与印尼胡椒出口贸易比较研究[D]. 南宁：广西大学. [Ding H S. 2017. Comparative research on export of pepper between Vietnam and Indonesia[D]. Nanning：Guangxi University.]

郭虹，任武洁，魏玉霞，王建国. 2018. 分散固相萃取—超高效液相色谱—串联质谱法测定蔬菜中7种植物生长调节剂[J]. 中国卫生检验杂志，28（6）：660-663. [Guo H，Ren W J，Wei Y X，Wang J G. 2018. Determination of 7 kinds of plant growth regulators in vegetables by dispersive solid phase extraction ultra performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology，28（6）：660-663.]

廖艳华，唐阳，周劭桓，林文斯，周能志，陈杰，梁川. 2018. 基质分散固相萃取和超高效液相色谱—串联质谱法测定水果、蔬菜中的11种杀菌剂[J]. 现代预防医学，45（7）：1268-1273. [Liao Y H，Tang Y，Zhou S H，Lin W S，Zhou N Z，Chen J，Liang C. 2018. Determination of 11 fungicides in fruits and vegetables by matrix dispersive solid phase extraction and UPLC-MS/MS method[J]. Modern Preventive Medicine，45（7）：1268-1273.]

劉进玺，秦珊珊，冯书惠，王会锋，杨亚琴，钟红舰. 2016. 高效液相色谱—串联质谱法测定食用菌中农药多残留的基质效应[J]. 食品科学，37（18）：171-177. [Liu J X，Qin S S，Feng S H，Wang H F，Yang Y Q，Zhong H J. 2016. Matrix effects in the analysis of pesticides residues in edible fungi by HPLC-MS/MS[J]. Food Science，37（18）：171-177.]

罗媛媛，万伟杰，胡丽芳. 2018. 液相色谱串联质谱法测定动物源性食品中喹乙醇代谢物残留量的不确定度分析[J]. 江西农业学报，30（6）：92-97. [Luo Y Y，Wan W J，Hu L F. 2018. Uncertainty analysis of determination of olaquindox metabolite residues in animal-derived foodstuff by LC/MS/MS[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（6）：92-97.]

马智玲，赵文，李凌云，郑姝宁，林桓，张延国，高青珍，刘肃. 2013. 气相色谱—三重四极杆串联质谱法快速测定蔬菜水果中129种农药的残留量[J]. 色谱，31（3）：228-239. [Ma Z L，Zhao W，Li L Y，Zheng S N，Lin H，Zhang Y G， Gao Q Z，Liu S. 2013. Rapid determination of 129 pesticide residues in vegetables and fruits by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography，31（3）：228-239.]

宁霄，金绍明，高文超，曹进，丁宏. 2018. QuEChERS-超高效液相色谱—串联质谱法测定动物源性食品中氟虫腈及其代谢物残留[J]. 分析化学，46（8）：1297-1305. [Ning X，Jin S M，Gao W C，Cao J，Ding H. 2018. Determination of fipronil and its metabolites in vegetative foods by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry，46（8）：1297-1305.]

田甜，赵德恩，文金华. 2018. 分散固相萃取—气相色谱—质谱法测定蔬菜中5种农药的残留量[J]. 农药，57（10）：747-752. [Tian T，Zhao D E，Wen J H. 2018. Determination of 5 pesticides in vegetable by dispersing solid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry[J]. A-grochemicals，57（10）：747-752.]

易盛国，侯雪，韩梅，骆正联，刘又铭，刘凤. 2012. 气相色谱—串联质谱法检测蔬菜农药残留基质效应与基质分类的研究[J]. 西南农业学报，25（2）：537-543. [Yi S G，Hou X，Han M，Luo Z L，Liu Y M，Liu F. 2012. Study on matrix effects and matrix classification of pesticide residues in vegetable by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Southwest China Journal of Agricultural Scien-ces，25（2）：537-543.]

尹桂豪，王明月，吕岱竹. 2003. 毛细管柱气相色谱法测定胡椒中有机磷农药残留量[J]. 热带作物学报，24（4）：81-83. [Yin G H，Wang M Y，Lü D Z. 2003. Determination of residual organophosphorus pesticides in pepper by ca-pillary GC[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，24（4）：81-83.]

张延平，沈丹玉，陈振超，钟冬莲，莫润宏，韩永翔，汤富彬. 2018. 分散固相萃取—气相色谱/串联质谱法测定竹笋中38种持久性有机污染物[J]. 分析试验室，37（6）：671-676. [Zhang Y P，Shen D Y，Chen Z C，Zhong D L，Mo R H，Han Y X，Tang F B. 2018. Determination of 38 persistent organic pollutants in bamboo shoot by dispersive solid phase extraction gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory，37（6）：671-676.]

张月，徐志. 2013. 高效液相色谱荧光法测定胡椒中的阿维菌素[J]. 湖北农业科学，52（2）：425-427. [Zhang Y，Xu Z. 2013. Determination of the residue of abamectin in pe-pper by HPLC[J]. Hubei Agricultural Sciences，52（2）：425-427.]

郑维全，杨建峰，鱼欢，李志刚，祖超，王灿，桑利伟，刘爱勤. 2017. 我国胡椒产业现状与创新发展探析[J]. 热带农业科学，37（12）：102-108. [Zheng W Q，Yang J F，Yu H，Li Z G，Zu C，Wang C，Sang L W，Liu A Q. 2017. Present status and innovation development of black pepper industry in China[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture，37（12）：102-108.]

Bryant Christie Inc. 2018. MRL Database[EB/OL]. http：//www.mrldatabase.com/.

Chai L K，Elie F. 2013. A rapid multi-residue method for pesticide residues determination in white and black pepper（Piper nigrum L.）[J]. Food Control，32（1）：322-326.

Codex Alimentarius. 2017. International Food Standards[EB/OL]. http：//www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/standards/pestres/pesticides/zh/.

European Commission. 2017. Pesticides Web Version-EU MRLs[EB/OL]. http：//ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database/public/？event=pesticide.residue.Curre-ntMRL&language=EN&pestResidueId=188.

Goon A，Khan Z，Oulkar D，Shinde R，Gaikwad S，Banerjee K. 2018. A simultaneous screening and quantitative method for the multiresidue analysis of pesticides in spices using ultra-high performance liquid chromatography-high resolution（Orbitrap） mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，1532：105-111.

Goverment of Canada. 2019. MRL Database[EB/OL]. http：//pr-rp.hc-sc.gc.ca/mrl-lrm/results-eng.php.

Wiratno，Taniwiryono D，Van den Brink P J，Rietjens I M，Murk A J. 2007. A case study on Bangka Island，Indonesia on the habits and consequences of pesticide use in pepper plantations[J]. Environmental Toxicology，22（4）：405-414.

Yao W，Zhang Z H，Song S Y，Hao X H，Xu Y J，Han L J. 2019. Multi-residue analysis of 34 pesticides in black pepper by QuEChERS with d-SPE vs. d-SLE cleanup[J]. Food Analytical Methods，12：176-189.

（責任编辑 罗 丽）