RP—HPLC法同时测定痢必灵片中6种成分的含量

徐阳 单柏宇 鲍慧玮

中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）04-0454-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.05

摘 要 目的：建立同时测定痢必灵片中苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯和去氢木香内酯含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm（苦参碱、氧化苦参碱）、225 nm（没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯），柱温为30 ℃，进样量为5 μL。结果：苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯和去氢木香内酯检测质量浓度线性范围分别为0.053～5.28 mg/mL（r=0.999 8）、0.125～12.54 mg/mL（r=0.999 9）、0.013～1.33 mg/mL（r=0.999 8）、0.169～16.94 mg/mL（r=0.999 9）、0.048～4.77 mg/mL（r=0.999 8）、0.072～7.16 mg/mL（r=0.999 9）；定量限分別为4.08×10-4、4.48×10-4、3.12×10-4、2.10×10-4、1.36×10-4、1.84×10-4 mg/mL，检测限分别为1.24×10-4、1.50×10-4、1.02×10-4、6.20×10-5、4.20×10-5、6.40×10-5 mg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%（n=6）；加样回收率分别为98.03%～101.43%（RSD=1.25%，n=6）、97.73%～102.26%（RSD=1.96%，n=6）、97.18%～101.41%（RSD=1.98%，n=6）、97.45%～102.11%（RSD=1.88%，n=6）、96.85%～101.07%（RSD=1.75%，n=6）、97.12%～102.64%（RSD=1.82%，n=6）。结论：该方法操作简便，稳定、快速，可用于同时测定痢必灵片中6种成分的含量。

关键词 痢必灵片；反相高效液相色谱法；苦参碱；氧化苦参碱；没食子酸；芍药苷；木香烃内酯；去氢木香内酯；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of matrine， oxymatrine， gallic acid， peoniflorin， costunolide and dehydrocostus lactone in Libiling tablets. METHODS： RP-HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 210 nm （matrine， oxymatrine） and 225 nm （gallic acid， peoniflorin， costunolide， dehydrocostus lactone）. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 5 µL. RESULTS： The linear ranges of matrine， oxymatrine， gallic acid， peoniflorin， costunolide， dehydrocostus lactone were 0.053-5.28 mg/mL（r=0.999 8）， 0.125-12.54 mg/mL（r=0.999 9）， 0.013-1.33 mg/mL（r=0.999 8）， 0.169-16.94 mg/mL（r=0.999 9）， 0.048-4.77 mg/mL（r=0.999 8）， 0.072-7.16 mg/mL （r=0.999 9）. The limits of quantitation were 4.08×10-4， 4.48×10-4， 3.12×10-4， 2.10×10-4， 1.36×10-4， 1.84×10-4 mg/mL， respectively. The limits of detection were 1.24×10-4， 1.50×10-4， 1.02×10-4， 6.20×10-5， 4.20×10-5， 6.40×10-5 mg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. The recoveries were 98.03%-101.43% （RSD=1.25%， n=6）， 97.73%-102.26% （RSD=1.96%， n=6）， 97.18%-101.41% （RSD=1.98%，n=6）， 97.45%-102.11% （RSD=1.88%，n=6）， 96.85%-101.07% （RSD=1.75%， n=6）， 97.12%-102.64% （RSD=1.82%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： Established method is simple， stable and rapid， and can be used for simultaneous determination of 6 components in Libiling tablets.

KEYWORDS Libiling tablets； RP-HPLC； Matrine； Oxymatrine； Gallic acid； Peoniflorin； Costunolide； Dehydrocostus lactone； Content determination

痢必灵片是由苦参、白芍、木香等3味中药提取制成的中药成方制剂，其处方收载于2015年版《中国药典》（一部）[1]。该药具有清热、去湿、止痢之功效，可用于治疗大肠湿热所致的痢疾、泄泻、症见发热腹痛、大便脓血、里急后重。方中苦参的主要药效成分为生物碱类化合物苦参碱和氧化苦参碱，其具有清热燥湿的功效[2-3]；芍药苷为白芍的指标性成分，具有缓急止痛、抗炎、抑菌等作用[4]；木香中的倍半萜内酯类化合物木香烃内酯和去氢木香内酯，是其发挥行气止痛、调中导滞功效的物质基础[5]；没食子酸是3味中药的共有成分，其在抗菌、抗病毒、抗炎等方面作用显著[6]。2015年版《中国药典》（一部）[1]及相关文献[7-9]中仅将苦参碱或芍药苷作为痢必灵含量测定的指标，但中药的有效成分多而复杂，单一成分的含量测定在一定程度上不能准确、全面地反映中药质量。为此，在本研究中笔者采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）建立了同时测定痢必灵片中苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯和去氢木香内酯含量的方法，旨在为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260型 HPLC仪，包括二极管全波长阵列检测器、自动进样器、四元梯度泵（美国Agilent公司）；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（宁波江南仪器厂）；DHG-912A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密科学仪器有限公司）；AB135-S型分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；R系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；DP30A型单冲压片机（北京国药龙立科技有限公司）。

1.2 藥品与试剂

痢必灵片（长春中医药大学自制，批号：20170801、20170802、20170803，规格：0.44 g/片）；苦参碱对照品（批号：110805-200815，纯度：98%）、氧化苦参碱对照品（批号：110780-200317，纯度：98%）、木香烃内酯对照品（批号：111524-200514，纯度：92%）、去氢木香内酯对照品（批号：111525-200001，纯度：95%）均购于中国食品药品检定研究院；没食子酸对照品（批号：110831-201205，纯度：98%）、芍药苷对照品（批号：110736-200833，纯度：98%）均购于南京景竹生物科技有限公司；甲醇[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；磷酸（分析纯，北京化工厂）；纯净水（杭州娃哈哈股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm（苦参碱、氧化苦参碱）、225 nm（没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取苦参碱对照品5.28 mg、氧化苦参碱对照品12.54 mg、没食子酸对照品1.33 mg、芍药苷对照品16.94 mg、木香烃内酯对照品4.77 mg、去氢木香内酯对照品7.16 mg，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇，超声（功率：250 W，频率：40 kHz，下同）溶解并定容至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品粉末约2 g，置于25 mL具塞锥形瓶中，加甲醇15 mL，称定质量，超声处理15 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按本品处方比例分别制备缺苦参、缺苦参-白芍-木香、缺苦参-白芍、缺苦参-木香的阴性样品，并按“2.2.2” 项下方法制备各阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各待测成分与其他色谱峰均能达到基线分离，分离度均大于1.5，理论板数均不低于2 000，且在相同位置上阴性样品对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1、0.5、1、2、5、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得系列线性关系工作溶液。精密量取上述系列线性关系工作溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围，见表2。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按 “2.1”项下色谱条件进样测定，分别以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1计算定量限、检测限。结果，苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯的定量限分别为4.08×10-4、4.48×10-4、3.12×10-4、2.10×10-4、1.36×10-4、1.84×10-4 mg/mL，检测限分别为1.24×10-4、1.50×10-4、1.02×10-4、6.20×10-5、4.20×10-5、6.40×10-5 mg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20170801）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的RSD分别为1.71%、1.52%、1.33%、1.25%、1.72%、1.67%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20170801）适量，分别于室温下放置0、3、6、9、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的RSD分别为0.38%、0.90%、0.74%、0.50%、0.15%、0.71%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取样品（批号：20170801）粉末适量，共6份，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各待测成分含量。结果，苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯的平均含量分别为3.966、9.391、0.668、12.592、3.610、5.271 mg/g，RSD分别为0.80%、0.64%、0.82%、0.24%、0.50%、0.23%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：20170801）粉末约1 g，共6份，分别加入混合对照品溶液（苦参碱、氧化苦参碱、没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香内酯的质量浓度分别为4.120、10.070、0.710、12.580、3.550、5.340 mg/mL）1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.10 耐用性试验

分别取“2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件[分别以不同色谱柱（美国Agilent 公司ZORBAX SB-C18、TC-C18和美国Waters公司XBridge- C18）、流动相（B）浓度比例（0.05%、0.10%、0.15%磷酸）、不同流速（0.95、1.00、1.05 mL/min）、不同柱温（25、30、35 ℃）]进样测定，记录峰面积并计算各待测成分含量，结果见表4。结果表明，该方法能够满足试验要求，耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取3批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各待测成分含量，结果见表5。

3 讨论

笔者参考相关文献[10-13]，分别考察了不同提取方法（超声提取法、回流提取法、温浸法、索氏提取法）、不同提取溶剂（乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯）和不同提取时间（10、15、20、25、30 min）对提取效率的影响，结果发现以甲醇为提取溶剂、超声提取15 min时的提取效率最好。

笔者参考2015年版《中国药典》（一部）[1]和相关文献[14-15]采用双波长检测各待成分。结果，检测波长为210 nm（苦参碱、氧化苦参碱）、225 nm（没食子酸、芍药苷、木香烃内酯、去氢木香烃内酯）时的分离效果最好、检测信号最强。

笔者又对不同流动相组成（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液）和不同进样量（5、10、15 μL）进行了比较。结果，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱）、进样量为5 μL时，各待测成分色谱峰与邻近色谱峰分离度良好，出峰时间适宜。

综上所述，本研究所建方法操作简便，稳定、快速，可用于同时测定痢必灵片中6种成分的含量。

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（收稿日期：2018-06-30 修回日期：2018-12-11）

（编辑：陈 宏）