烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

文利超 吴凤燕 李伟 郭永峰

摘  要：成熟葉片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况，本研究以普通烟草红花大金元为材料，采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法，分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示，烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因、、、、、和呈现下调表达，类胡萝卜素降解基因、和呈现上调表达，和呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因、、呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因、、、呈现下调表达，而、呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老，类胡萝卜素合成减弱，而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。

关键词：类胡萝卜素;转录组;类胡萝卜素代谢基因;qRT-PCR;烟草

中图分类号：S572.03          文章编号：1007-5119（2019）04-0062-07      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.010

Analysis of Carotenoid Metabolism and Related Gene Expressions during Senescence of Tobacco Leaves

WEN Lichao， WU Fengyan， LI Wei， GUO Yongfeng

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Carotenoid content in mature leaves is important for tobacco quality. In order to explore the changes of carotenoid components and related gene expression during tobacco leaf senescence， the contents of neoxanthin， lutein and β-carotene in the middle leaves of Honghuadajinyuan were analyzed in leaves from different developmental stages using liquid chromatography. Meanwhile， the expression of genes related to carotenoid metabolism was analyzed based on transcriptome data and quantitative real-time PCR verification. The results showed that the contents of neoxanthin， lutein， and β-carotene in tobacco leaves gradually decreased during tobacco leaf senescence and the carotenoid synthesis genes ， ， ， ， ，  and  were down-regulated. The carotenoid-degrading genes ，  and  were up-regulated and  and  were down-regulated. The carotenoid converting genes ，  and  were up-regulated. The transcription factors involved in the carotenoid synthesis process ， ，  and  were down-regulated， while  and  were up-regulated. The results showed that， with the aging of tobacco leaves， the synthesis of carotenoids decreased and the degradation increased. The results from this study will facilitate in depth understanding of the molecular regulation of carotenoid metabolism during the maturation and senescence of tobacco leaves and promote genetic improvement of tobacco varieties targeting carotenoid content.

 carotenoids; transcriptome; carotenoid metabolic genes; qRT-PCR; tobacco

类胡萝卜素是由8个异戊二烯单位组成，主要呈现红色、橙红色和黄色的色素物质。在植物体内，其分布于叶绿体中，主要包括叶黄质（Lutein）和胡萝卜素（Carotene）两大类。在烟草中，类胡萝卜素的含量与烟叶的品质密切相关，一方面类胡萝卜素含量直接决定烟叶的外观质量，另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的前体物质，其降解产物阈值相对较低，刺激性小，香气质较好，是烟叶中挥发性香气成分的主要来源。多项研究已表明，烟叶的质量与类胡萝卜素降解产物的含量呈正相關。同时，类胡萝卜素具有提高光合效率、抑制和清除自由基的作用，对改善烟叶品质和降低烟气自由基伤害也具有重要意义。

类胡萝卜素在植物体内的生物合成及转化途径目前已经研究比较清楚，异戊二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）依次在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（GGPS）、八氢番茄红素合成酶（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）、ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）及类胡萝卜素异构酶（CRTISO）的作用下形成全反式番茄红素。随后，全反式番茄红素经过番茄红素ε-环化酶（LCYE）或番茄红素β-环化酶（LCYB）催化下发生环化，分别形成α-胡萝卜素或β-胡萝卜素。在α-胡萝卜素由β-环羟化酶（ECH）和ε-环羟化酶（BCH）共同催化转化成叶黄质（Lutein）;另一分支途径中的β-胡萝卜素在BCH酶的两次催化下发生羟基化反应转化为玉米黄素（Zeaxanthin），玉米黄素环氧酶（ZEP）和新黄质合成酶（NXS）依次催化最终将玉米黄素转化为新黄质（Neoxanthin）。

相对于类胡萝卜素的生物合成，其降解过程的研究进展较慢。类胡萝卜素裂解双氧合酶（CCDs）是植物类胡萝卜素降解代谢途径中的关键酶。烟叶中CCDs通过降解不同类胡萝卜素底物的不同双键，产生不同碳原子数的化合物，最终生成多种致香物质。脂肪氧化酶（LOX）是催化类胡萝卜素氧化降解的关键酶，主要催化类胡萝卜素和1，4-二烯不饱和脂肪酸的过氧化，产生与香味有关的挥发性羰基化合物。ENZELL等研究表明，许多致香物质如：香叶醇、紫黄质、β-二氢大马酮等均是由LOX酶催化而成。此外，宋朝鹏等研究发现，烟叶烘烤变黄过程中类胡萝卜素的降解速度与多酚氧化酶（PPO）、脂氧合酶（LOX）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等各种酶活性具有一定的相关性。类胡萝卜素除了降解生成各种香气成分外，代谢途径中间产物堇菜黄素和新黄质经9-顺式环氧类胡萝卜素单加氧酶（NCED）催化形成ABA。

类胡萝卜素的代谢途径是一个非常复杂的过程，由多个转录因子共同参与其调控。在烟草中过表达葡萄R2R3-MYB转录因子（VvMYB5b）能够明显提高烟草植株β-胡萝卜素含量。LIU等研究证明光信号传导基因和对番茄类胡萝卜素合成分别起着正调控和负调控作用，在RNAi转基因番茄中，叶片的光形态发生受到一定的抑制，叶片中的类囊体数目与类胡萝卜素合成明显降低;而抑制基因则促进光形态发生，增加了植物体内的类胡萝卜素含量。DAVULURI等通过RNAi技术抑制番茄果实中光敏色素基因的表达，导致果实中类胡萝卜素含量增加。GILIBERTO等在番茄中超量表达隐花色素基因，果实中类胡萝卜素含量明显升高。另外，ORANGE基因在质体膜周围发挥功能，起到类胡萝卜素代谢库的作用，并且，该基因在成熟叶片中表达量较高，其他组织器官相对较弱，这可能与烟叶类胡萝卜素的积累有关。

目前，烟叶成熟衰老过程中，类胡萝卜代谢及相关基因的表达变化规律研究尚少。本试验以普通烟草红花大金元为材料，分析打顶后烟叶类胡萝卜素的含量变化;利用转录组分析和qRT-PCR技术对样品类胡萝卜素代谢相关基因表达进行定量验证，初步明确了烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢的变化规律，为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控奠定基础。

1  材料与方法

1.1  试验试剂与材料

1.1.1  供试材料  普通烟草（）红花大金元，由中国农业科学院烟草研究所种子资源中心提供。

1.1.2  试验试剂  SYBR® Fast qPCR Mix、Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）等试剂均购自宝生物工程（大连）有限

公司;标准品，包括新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素，均为色谱纯，购自日本WAKO公司;丙酮、甲醇、乙腈，均为色谱纯，购自德国MERCK公司。

1.2  试验方法

1.2.1  样品采集  以大田生长的普通烟草（红花大金元）中部叶（自下而上第9～10片有效叶）作为研究对象，取样烟株不进行采收，于打顶后15，25，35，45，55，65，75，85 d取样，直到打顶85 d后中部叶片逐渐脱落，取样结束。每次取样时选择生长状态一致的烟株12株，每3株的同一叶位中部叶混合为一个样本，共4次生物学重复，用于类胡萝卜素含量测定和RNA提取。收集后的叶片用锡箔纸包裹后迅速置于液氮中速冻，−80 ℃保存备用。

1.2.2  类胡萝卜素含量测定  样品前处理：烟草叶片液氮研磨至细粉末状，冷冻干燥48 h，称取0.05 g左右冻干粉末于2 mL的离心管中，加入1 mL 90%丙酮，超声波萃取40 min，12000 rpm离心10 min。用1 mL注射器吸取上清液，过0.2 μm滤膜后装入棕色进样瓶。

色谱条件：Zorbax SB C18柱（4.6×250 mm，5 μm）;流动相∶∶=2∶14∶84;柱温25 ℃;流速1.0 mL/min;进样量10 μL;检测波长：新黄质445 nm;叶黄质460 nm;β-胡萝卜素455 nm。

1.2.3  類胡萝卜素代谢相关基因转录组分析  采用一种高效提取烟草成熟叶片总RNA的方法提取各时期叶片总RNA，并送至华大公司进行转录组测序分析。以15 d作为对照，后续时间点与15 d进行两两比较。以|log 2 Ratio|≥1.0和FDR≤0.001为筛选标准，获得烟草叶片衰老过程中上调基因集和下调基因集。

在NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中检索与类胡萝卜素代谢相关的蛋白序列，在中国烟草基因组数据库中进行比对（未公开发表），提取相似率在90%以上的基因ID;用比对上的ID号从实验室已有的转录组数据中选择差异表达（|log 2 Ratio|≥1，≤0.05）ID号（表1），利用热图绘制软件GPS，Heml绘制基因表达热图。

1.2.4  类胡萝卜素代谢基因qRT-PCR验证  参照宝生物RNAiso Plus试剂盒说明书提取烟草叶片总RNA，利用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（宝生物）进行反转录获得cDNA。

选取打顶后15 d（未衰老叶片）、45 d（衰老早期叶片）、65 d（衰老中期叶片）和75 d（衰老晚期叶片）4个代表性时期的烟草叶片cDNA为模板，利用Premier Prime 5.0软件设计类胡萝卜素代谢相关基因的qRT-PCR引物（表1），ABI7500型实时荧光定量PCR仪进行SYBR GREEN I Real-Time PCR反应，以看家基因为内参，相应基因在打顶后15 d的表达量为单位1，采用2−ΔΔCt法计算该基因在45、65和75 d的相对表达量，SPSS 22.0进行方差分析。

2  结  果

2.1  烟草不同发育时期叶片中类胡萝卜素含量

由图1可以看出，烟草成熟衰老过程中，叶片中类胡萝卜素各组分呈现下降趋势，包括新黄质、叶黄质、β-类胡萝卜素;衰老后期（75～85 d时），新黄质含量下降最明显，从15 d的0.105 mg/g下降到0.005 mg/g，85 d与15 d相比含量下降了95%;叶黄质在15 d时含量为0.812 mg/g，85 d时含量为0.113 mg/g，85 d和15 d相比含量下降了86%;β-类胡萝卜素在15 d时含量为1.060 mg/g，85 d时含量为0.133 mg/g，85和15 d相比含量下降了87%。以上结果显示叶片中类胡萝卜素含量随着烟叶成熟衰老逐步降低。

2.2  叶片衰老时期类胡萝卜素代谢基因转录组数据分析

在本试验中，共检索到26个类胡萝卜素代谢相关基因（图2），涉及类胡萝卜素合成、转化、降解以及调控等过程。图2显示，随着烟叶成熟衰老，类胡萝卜素合成上游基因、、、和在整个衰老时期均下调表达，其中下调最明显，在85 d时表达量比15 d下降了91%，PSY在65 d时表达量下调到15 d的1/5，、和在衰老叶片中的表达量下降到15 d的1/2左右;类胡萝卜素合成途径下游相关基因、下调表达，在65 d时表达量约降低到15 d的30%，和衰老后期略微上调;与类胡萝卜素转化相关的基因、、上调表达，其中的表达量上升最明显，65 d后表达量上调65倍，在55 d之后表达量上调4.31倍，逆转化基因在85 d之前略微下调。类胡萝卜素降解相关基因分别是、、、和，其中和在衰老过程上调表达，上调2.55倍，上调36.68倍，而、和下调表达。参与类胡萝卜素代谢的转录因子较多，包括、、、、、及其同源基因，其中、上调表达，上调最明显，表达量提高4.52倍，下调基因有、、和。图2中基因表达变化说明类胡萝卜素代谢是通过多个基因协同调控实现的，相关基因表达变化趋势同

2.3  叶片衰老时期类胡萝卜素代谢基因qRT-PCR分析

qRT-PCR分析表明（表2），类胡萝卜素代谢上游合成基因在叶片衰老过程中下调表达，65 d时表达量下调至0.74倍，基因在45 d时上调表达，45 d后该基因表达量明显下降。下游合成基因、下调表达，75 d时表达量分别下降至15 d的0.50倍和0.21倍;类胡萝卜素转化基因、、呈现上调表达，在65 d时表达量分别上调9.20、3.25和3.21倍，而在整个衰老时期下调表达，在75 d时下调至15 d的0.32倍。其中，类胡萝卜素转化为ABA的关键基因明显上调，表明衰老叶片中类胡萝卜素正在积极地转化为ABA，从而促使叶片衰老过程的持续进行。另外，类胡萝卜素降解基因表达量在45 d后明显下降，而与基因上调显著，75 d时分别上调3.9倍和18.09倍。调节类胡萝卜素合成的转录因子HY5、COP1、DET1在烟叶衰老过程中表达量呈现下调趋势。其中COP1和DET1下调最明显，75 d时表达量分别下降到15 d的0.45倍和0.38倍。而表达量在衰老叶片中上调表达，65 d时表达量上调至15 d的7.55倍。定量分析结果与转录组分析结果基本一致，这说明转录组测序结果能够反映类胡萝卜素代谢相关基因在衰老过程中的表达情况。

3  讨  论

类胡萝卜素降解是烟草叶片衰老过程的重要过程。本研究表明，类胡萝卜素在烟叶衰老过程中是逐渐降低的，类胡萝卜素合成途径上游基因、、、、在烟叶进入衰老期后呈现下调表达，这与测定的类胡萝卜素含量下降数据一致。和作为合成支路上的两个关键酶基因对代谢途径物质流走向和类胡萝卜素组分的变化起着重要作用。全反式番茄红素在LYCE酶催化下生成δ-胡萝卜素，随后在LYC及ECH/BCH酶催化下生成终产物叶黄质，衰老转录组数据和定量验证结果显示，表达量在65 d后明显下调，而该分支下游酶基因/在衰老后期表达变化不明显，这进一步说明基因在衰老过程中的下调表达是衰老叶片中叶黄质含量降低的主要原因。另一分支途径中，催化

全反式番茄红素生成β-类胡萝卜素，定量数据显示，基因在烟叶衰老过程中呈现持续下调的表达模式，且该基因下调速度明显大于，这与烟叶衰老过程中β-类胡萝卜素含量下降比叶黄质含量下降速度快的结果相吻合。上述结果表明和基因表达的相对强弱对下游途径中δ-胡萝卜素和β-胡萝卜素相关产物的积累起着决定性的作用。

ABA是促进叶片衰老的重要激素，可以调节植物对于非生物逆境的适应能力。在类胡萝卜生物合成途径中，ABA是由分支途径催化的最终产物，玉米黄质经过ZEP、NXS、NCED 3个关键酶一步步催化合成ABA。其中，NCED作为关键限速酶直接调控内源ABA含量，在衰老过程中上调最为显著。ZEP除了在ABA生物合成途径中发挥着重要作用外，还在叶片、茎等叶绿体含量比较丰富的组织中参与植物的叶黄素循环。此外，在植物的特定生长发育阶段以及种子等非光合器官中，的表达水平同样限制着ABA的合成。衰老转录组数据和定量验证结果显示，该途径关键酶基因、、在烟叶进入衰老期后均呈现上调表达。类胡萝卜素代谢途径中间产物新黄质和β-类胡萝卜素作为ABA的前体被大量消耗，再加上上游基因的下调表达，使新黄质和β-类胡萝卜素含量大大降低。

在类胡萝卜素的降解代谢中、、均有十分重要的作用，其中基因是催化类胡萝卜素降解产生的醛类与酮类物质的关键基因，降解的产物有香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛等，能够改善烟叶的品质。本试驗也表明，在烟叶衰老过程中，类胡萝卜素降解基因、、均呈现上调表达。

本试验结合转录组数据及qRT-PCR验证分析，研究了烟叶衰老过程中类胡萝卜素的合成、转化和降解过程中关键基因的表达变化规律，如何在分子水平上对类胡萝卜素代谢进行调控，提高烟叶香气质和香气量，应作为今后烟叶致香物质研究的重点。

4  结  论

研究表明，烟草叶片衰老过程中新黄质、叶黄质、β-类胡萝卜素含量不断下降。类胡萝卜素合成相关基因在烟叶衰老过程中下调表达，包括、、、以及/;催化烟叶中类胡萝卜素转化为ABA的合成代谢基因表达量增加，包括、、;与类胡萝卜素降解相关的基因、、表达上调。类胡萝卜素代谢途径中的转录因子基因，上调最明显，、下调表达。本研究结果为通过分子手段调控类胡萝卜素代谢过程改良烟叶品质、选育优良品种提供了一定的理论参考。

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