23种中草药的体外抗菌活性筛选研究

张泽萍 胡欢 左国营

摘 要：為考察中草药抗菌物质基础筛选出活性提取物，该研究通过80%乙醇冷浸和95%乙醇回流提取制备23种中草药的提取物，采用琼脂扩散法测量抑菌圈直径，用微量液体培养基倍比稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal/fungicidal concentration，MBC/MFC），并测定了提取物对临床4种常见病原菌体外抗菌活性。结果表明：紫珠草、千斤拔、黄龙尾等9种中草药对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性，其MIC/MBC值除个别菌是12.5 mg·mL-1外，其他都在0.09～3.12 mg·mL-1之间;千斤拔、大红袍、过江龙等5种中草药对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性，其MIC/MBC值在3.12～12.5 mg·mL-1之间;紫珠草、千里光、石楠等13种中草药对大肠埃希菌有较强的抑菌活性，其MIC/MBC值在0.09～6.25 mg·mL-1之间;八角对白色念珠菌有较强抑菌活性，其MIC/MFC值在0.78～12.5 mg·mL-1之间。23种中草药的抗细菌活性较好，尤其是千斤拔、大红袍、过江龙、八角、黄药子对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌都具有较好的抑菌活性，具有广谱抗菌活性;但对真菌抑菌效果不明显，仅有八角对白色念珠菌有抑菌活性。此外，提取溶剂浓度、提取温度和提取时间对中草药的提取率和活性均有影响，冷提稍优于热提。

关键词：中草药， 金黄色葡萄球菌， 铜绿假单胞菌， 大肠埃希菌， 白色念珠菌， 体外抗菌

中图分类号：Q946， R285

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2019）04-0499-12

Abstract：In order to investigate the antimicrobial material base of Chinese herbal medicine and screen the active extracts， 80% ethanol cold soaking and 95% ethanol reflux extraction were used to prepare the extracts from 23 traditional Chinese herbs. The agardiffusion method was used to measure the inhibition zonediameters（IZDs）， the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal / fungicidal concentration（MBC/MFC） were measured by the microdilution method todetermine the in vitro antimicrobial activity of the extracts against four common clinical pathogenic microoranisms. The results showed that some of the 23 ethanol extracts had strong inhibitory effects， among which nine species like Callicarpa macrophylla， Flemingia philippinensis and Agrimonia pilosa extracts showed stronger inhibition against Staphylococcus aureus. The ranges of MICs/MBCs were between 0.09 and 3.12 mg·mL-1， except for a small number of strains with the MIC/MBC at 12.5 mg·mL-1. The extracts from five species like Flemingia philippinensis， Campylotropis hirtella， and Entada phyaseoloides showed stronger inhibition against Pseudomonas aeruginosa， the ranges of MICs/MBCs were between 3.12 and 12.5 mg·mL-1. The extracts from thirteen species like Callicarpa macrophylla， Senecio scandens and Piper wallichii showed stronger inhibition against Escherichia coli， the ranges of MICs/MBCs were between 0.09 and 6.25 mg·mL-1. The extracts from Illicium verum showed stronger inhibition against Candida albicans， the ranges of MICs/MFCs were between 0.78 and 12.5 mg·mL-1. Generally， the ethanol extracts from 23 traditional Chinese herbs showed good antibacterial activities， especially Flemingia philippinensis， Campylotropis hirtella， Entada phaseoloides， Illicium verum and Dioscorea bulbifera showed a broad spectrum of antibacterial activities against Staphylococus aureus， Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Their fungicidal effect was weak， only Illicium verum showed inhibitory effect on Candida albicans. In addition， extraction temperature， time and solvent concentration affected the extraction rate and the activity of extracteddrugs， with hot extraction slightly better than cold extraction.

Key words：traditional Chinese herbal medicine， Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa， Candida albicans， in vitro antimicrobial

自1943年青霉素应用于临床以来，抗生素对保障人类健康起到了重大作用。现在，抗生素的种类已达几千种，临床上常用的亦有几百种之多。我国是全球最大的抗生素生产国和使用国，年产抗生素原料药约21万t，每年人均消费抗生素量为138 g，是美国人均水平的10倍多（岳华和王育伟，2011）。据统计，我国每年直接或间接死于滥用抗生素的有约8万人，是世界上抗生素滥用问题最严重的国家之一（李福长和刘梨平，2014）。抗生素的广泛使用除了带给人类健康外，也出现了耐药性问题、不良反应等越来越严重的危害，尤其是抗生素耐药问题已经成为全球医学界的难题，是一个迫切需要解决的问题;中药是我国宝贵的资源，在治疗感染性疾病方面有着悠久的历史，其成分复杂、靶点多、抗菌谱广，作用于抗菌的各个环节，调节机体免疫，能延缓甚至逆转细菌耐药，对于抗菌有其独特的优势。以此为契机，从中药材中寻找有效、低毒的抗菌药物，研究中药抗耐药菌的作用，开发利用中药对解决细菌耐药性这一难题，不失为一种新的有效途径。

中草药在体外抗菌活性方面的筛选，国外文献相关报道比较多，比如，评价50种中草药抗幽门螺旋杆菌的活性（Ma et al.， 2010）、从中草药中寻找抗肠道病毒71的活性分子（Wang et al.， 2016）和大西洋摩洛哥大海藻提取物抑菌活性的筛选（El Wahidi et al.， 2015），涉及各科属的中草药和多种病原微生物;从筛选的结果来看，许多中草药具有显著而广谱的抗菌活性，且中草药对革兰氏阳性菌活性强于革兰氏阴性菌和真菌。

根据课题组前期工作，发现含有特殊结构如异戊烯基的黄酮类化合物具有较强的抑菌活性。为寻找具有该类抗菌活性成分的各科属植物，我们结合植物化学分类学考察，围绕中草药乙醇提取物对临床常见的4种致病菌，即金黄色葡萄球菌（SA， Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（PA， Pseudomonas aeruginosa）、大肠埃希菌（EC， Escherichia coli）、白色念珠菌（CA， Candida albicans）的标准菌。对10株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA）、10株铜绿假单胞菌耐药菌和8株白色念珠菌耐药菌进行了体外抗菌活性研究，选定23种云南省常见的中草药，制备其醇提取物、筛选其对该4种常见致病菌的体外抗菌活性，寻找抑菌活性较好的中草药，为后续研究其活性单体化合物，开发有效的抗多重耐药菌的中药制剂缓解细菌耐药性问题，提供一定的参考。

1 材料

1.1 菌株

标准菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC25913、ATCC25923、ATCC29213）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、大肠埃希菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCCY0109、ATCCSC5314）均购自昆明中国药品生物制品检定所。耐药菌株：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA 15、MRSA 23、MRSA 40、MRSA 82、MRSA 98、MRSA 166、MRSA 181、MRSA 187、MRSA 202、MRSA 747）、铜绿假单胞菌耐药株（PA 11、PA 109、PA 129、PA 238、PA 238、PA 250、PA 283、PA 294、PA 307、PA 314、PA 319）、白色念珠菌耐药菌（CA 100、CA 152、CA 592、CA 632、CA 649、CA 953、CA 956、CA 819），均由成都军区昆明总医院药学部临床微生物实验室从本院临床重症感染患者标本中分离得到，经过形态学和生化学鉴定。

1.2 培养基和试剂

培养基和药敏纸片：M-H（Mueller-Hinton）琼脂和肉汤培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司，批号为20131021、20130314）、沙保罗氏琼脂（杭州滨和微生物试剂有限公司，批号为150112）、液体沙氏培养基（青島高科园海博生物技术有限公司，批号为20160217），抗菌药物药敏纸片（由中国药品生物制品检定所提供）。实验所用中草药（均购自昆明螺蛳湾中药材市场）（表1）。

试剂：二甲基亚砜（DMSO，分析纯利安隆博华（天津）医药化学有限公司，批号为20151009），药用乙醇（昆明福海达化玻璃有限公司）。

2 方法

2.1 中药浸膏的制备

将23种中草药打成粗粉，采用冷浸和热回流的方法，每种药材称取两份，每一份40 g。冷浸：先用80%乙醇浸泡3次，即第一次7d，第二次4～5d，第三次3～4d;再用八层纱布过滤，旋转蒸发仪40 ℃回收溶剂，合并浸膏，得到冷提取物。热回流：先用95%乙醇回流提取3次，即第一次2 h，第二次1 h，第三次1 h;再八层纱布过滤，旋转蒸发仪40 ℃回收溶剂，合并浸膏，得到热提取物。浸膏于常温下保存，备用。

2.2 药液和菌液的制备

药液：称取50 mg的药物浸膏于（2 mL）EP管中，加入10%DMSO作为助溶剂，超声震荡使药物溶解，在超净工作台里加入灭菌生理盐水，配成浓度为50 mg·mL-1药液。菌液：将菌株接种于琼脂培养基上，细菌用M-H琼脂培养基，真菌用沙保罗氏琼脂，置于35 ℃恒温箱中培养20 h，采用0.5号麦氏比浊管配置细菌浓度为1.5×108 CFU·mL-1，真菌用细胞计数板配成1.0×106 CFU·mL-1，用于做药物敏感性和琼脂扩散法测量抑菌圈。细菌300倍稀释成5×105 CFU·mL-1，真菌100倍稀释成1.0×104 CFU·mL-1，用于最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC/MFC）的测定。

2.3 体外抑菌活性的测定

2.3.1 琼脂扩散法测定抑菌圈 首先用打孔器将琼脂平板打上6 mm的孔备用，每个平板均匀打上5个孔;然后用棉签沾取细菌浓度为1.5×108 CFU·mL -1的菌液均匀涂布于M-H琼脂平板，真菌菌液浓度为1.0×106 CFU·mL-1，涂布于沙保罗氏琼脂平板上;最后于每孔加入50 μL浓度50 mg·mL-1药液，药液不得溢出孔外。琼脂平板放入35 ℃恒温箱中培养20 h，用卡尺測量抑菌圈的直径，做3次平行实验，取平均值。根据药理学试验方法判断：抑菌圈<10 mm为耐药和无抑菌作用;10 mm为轻度敏感;11～15 mm为中度敏感;≥16 mm为高度敏感。SA、PA和CA 3种菌药敏测试结果详见表2、表3和表4，抗生素的抑菌圈以临床和实验室标准（Clinical and Labora-tory Standards Institute， CLSI）作为标准。

2.3.2 MIC和MBC/MFC的测定 采用微量液体培养基倍比稀释法，具体实验步骤参照文献（唐金凤等，2016）。

3 结果与分析

3.1 中草药提取率和抑菌圈

用琼脂扩散法测定抑菌圈，23种乙醇冷/热提的提取物对7株标准菌的抑菌圈如表5所示。（1）对3株标准SA，千斤拔的抑菌圈菌≥16 mm表现为高度敏感，紫珠草、黄龙尾、大红袍、过江龙、黄药子、泽漆、小叶藤黄的抑菌圈在10～16 mm之间表现为中轻度敏感。（2）对标准EC，紫珠草、千斤拔、大红袍、过江龙、黄药子、小叶藤黄的抑菌圈≥16 mm表现为高度敏感，千里光、石楠、黄龙尾、淫羊藿、合欢皮、泽漆、蛇床子、独活的抑菌圈在11～16 mm之间表现为中度敏感。（3）对标准PA，过江龙和黄药子的抑菌圈在10～12 mm间表现为轻中度敏感。（4）对标准CA，均表现为耐药。

3.2 MIC和MBC/MFC的测定结果

通过对抑菌圈测定结果和标准菌MIC和MBC/MFC测定结果的筛选，选取抑菌圈较大和对标准菌抑菌效果较明显的中草药测定其对耐药菌的抑菌活性。（1）有9种中草药对SA有较强的抑菌活性，分别是紫珠草、千斤拔、黄龙尾、大红袍、过江龙、八角、黄药子、泽漆、小叶藤黄，其对3株标准菌（ATCC25913、ATCC25923、ATCC29213）的MIC/MBC值在0.09～3.12 mg·mL-1之间（表6）。对10株MRSA的MIC/MBC值除个别菌是12.5 mg·mL-1外，其余都在0.09～3.12 mg·mL-1之间（表7）。（2）有5种中草药对PA有很强抑菌活性，分别是千斤拔、大红袍、过江龙、八角、黄药子，对1株标准菌（ATCC27853）的MIC/MBC值在3.12～12.5 mg·mL-1之间（表6）。对10株耐药菌的MIC/MBC值在3.12～12.5 mg·mL-1之间（表8）。（3）有13种中药材对EC有很强的抑菌活性，分别是紫珠草、千里光、石南藤、千斤拔、黄龙尾、大红袍、淫羊藿、过江龙、八角、黄药子、泽漆、独活、小叶藤黄，其对1株标准菌（ATCC25922）MIC/MBC值在0.09～6.25 mg·mL-1之间（表6）。（4）八角对CA有很强抑菌活性，对2株标准菌（ATCCY0109、ATCCSC5314）MIC/MFC值在3.12～6.25 mg·mL-1之间（表6）。对8株耐药菌的MIC/MFC值在0.78～12.5 mg·mL-1之间（表9）。

4 讨论

综合筛选结果显示，本次研究活性较好的中草药主要集中在豆科、木兰科、紫金牛科和薯蓣科，在药理作用方面，具有抗炎、解热镇痛、抗病毒和抗肿瘤的中草药抗菌活性较好，其中八角（木兰科）对四种菌均有较好的抑制作用，千斤拔（豆科）、过江龙（豆科）、大红袍（紫金牛科）、黄药子（薯蓣科）对SA、PA和EC均有较好的抑菌活性，且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有活性，显示了广谱的抗菌活性。从植物化学分类学来看，同一科属的中草药往往具有相似结构的化学成分和抗菌活性，所以今后筛选抗菌中草药可以从这几个科属中进一步寻找，为以后的中草药体外抗菌作用的筛选提供植物学参考。

文献表明八角抗菌活性主要是其挥发油和萜类成分，其对霉菌的抑菌效果明显优于细菌（黄丽贞等，2015），有文献报道八角挥发油具有较强的抗菌活性，如文献（Saraswathy et al.，2010）所示其总挥发油对SA有较强抑菌活性，抑菌圈为14 mm，与本研究抑菌圈11 mm均表现为中度抑制。同时，八角挥发油也作为作为食源性细菌的群体感应和生物膜形成抑制剂对SA和PA均有较强抑制活性（Rahman et al.，2017），与本研究相一致。大量文献表明，对千斤拔的研究仅仅停留在化学成分的提取分离，以及简单的抗菌实验（王明煜，2008），该文章中醇提取物对标准菌SA、EC、PA、CA的MIC分别是60、500、250、500 mg·mL-1，本文与之比较，MIC均较低，原因可能是所用标准菌株、提取溶剂浓度以及所用药材产地不一样，但是对革兰阴性和阳性菌均有抑制作用;本研究所用大红袍为紫金牛科植物铁仔的根，主要化学成分是鞣质、黄酮。有关铁仔（Myrsinea fricana）化学成分和抗菌活性的研究报道很少，Lu et al.（2007）从铁仔的茎中发现两个新的黄酮类化合物，其中myrsininone B化合物具很强的抗菌活性，所以推测大红袍中具有抗菌活性的可能是其黄酮成分，Ahmad et al.（2016）研究了铁仔不同提取部位对MRSA的抗菌活性，其中乙醇提取部位对60%MRSA具有高度抑菌活性，本研究对所测10株MASA均有较强的抑菌活性（MIC 0.09～0.39 mg·mL-1），两者研究相一致对MRSA均有较好的抑菌活性;有关山豆根的报道较多，其中对其抗菌成分的研究较多，粗提物的研究较少，大量文献表明其抗菌成分主要为生物碱与黄酮（姚裕群等，2016）。山豆根水煎液对CA有强的抑菌作用，醇提物对EC和SA的最小抑菌浓度为 31.25 mg·mL-1，山豆根总碱对EC、SA均有较强的抑制作用。本研究与其比较，采用了琼脂扩散法，SA和EC对山豆根95%乙醇热提取物分别表现为耐药和轻度敏感。微量液体培养基倍比稀释法测定其对SA 的MIC为0.78～12.5 mg·mL-1之间，对EC 的MIC为0.78 mg·mL-1，表现出差异的原因可能是实验方法、提取溶剂乙醇的浓度和中草药产地等不一样， 本研究目前 仅仅局限在粗提物的活性测定，今后的研究应该以抗菌活性为导向，探讨山豆根的活性成分。

有个别中草药在测定抑菌圈时抑菌圈<10 mm显示无抑菌活性，但是MIC和MBC/MFC测定结果却显示有抑菌活性，原因是抑菌圈是一个半定量的测定方法，在实验所测浓度为50 mg·mL-1的条件下无明显的抑菌圈，表明抑菌效果不明显，但是并不代表无抑菌活性。实验所用耐药菌株均由本院临床重症患者分离得到，如表2、表3、表4药敏测试结果所示确定为多重耐药菌。此外，本研究采用了冷提和热提两种方法对23种中草药提取率和活性的进行了对比，数据显示冷提的提取率和活性都稍优于热提，原因可能是热提温度较高会破坏提取物中某些活性成分化学结构，影响抑菌活性。此外，提取溶剂浓度和提取时间也是两个重要的因素，80%的乙醇浓度比较适中，提取范围较广，可以提取到中草药中低极性和高极性的化学成分，所以提取率较高，造成中草药的提取率和活性不一致的具体原因有待深入研究。

总的来说，本研究的中草药与以往研究者在测定抑菌活性方面存在差异受多种因素的影响，需要注意的是粗提物抗菌活性显著受所测菌种类型、提取溶剂的浓度、提取时间以及中草药产地和测试方法的影响，并且以上几种中草药的活性成分均未见与抗生素联合使用的报道。结合筛选结果和前人工作，推测千斤拔具有的抗菌活性可能与其异戊烯基黄酮类成分有关，所以本课题将进一步从千斤拔的有效黄酮成分的分离及其与抗生素联合作用方面进行深入研究。

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