大豆皂甙对高盐饮食小鼠血压和肠道菌群的影响

张光远 吴晓利 张志明 何冬旭

摘 要：目的：探究大豆皂甙通过影响肠道菌群对高盐引起的小鼠高血压的调控，并筛选起到稳定血压作用的目标肠道菌群，为新的功能食品和益生菌的开发提供科学依据。方法：15只健康成年雄性小鼠被随机分成3组：（1）喂食含0.5%NaCl的饲料（正常饮食，NSD组）;（2）喂食含8%NaCl的飼料（高盐饮食，HSD组）;（3）喂食含8%NaCl的饲料，高盐饮食9w后，饮食中添加大豆皂甙Bb，持续3w（高盐饮食+大豆皂甙，HSD_SI组）。实验结束前，分别收集3组小鼠新鲜粪便，提取粪便总DNA，并对16s rDNA的V3-V4区进行高通量测序，微生物多样性分析和差异OTU比对。结果：大豆皂甙可以显著降低由高盐饮食诱导的小鼠血压升高。同时减少部分在高盐饮食过程中显著增加的OTU的丰度，这部分OTU中可能包含使机体血压升高的有害菌;另外使部分在高盐饮食过程中减少的OTU的丰度得到恢复和增加，这部分OTU中可能存在潜在的可以降低机体血压的益生菌。推论：大豆皂甙可能通过影响肠道菌群而调控血压。

关键词：大豆皂甙;高血压;肠道菌群

高盐饮食诱导血压升高的机制研究主要集中在肾脏和交感神经系统[1-4]，不过，Wilck等[5]的发现使研究者们的注意力转移到机体自身肠道菌群对血压的影响上。大豆皂甙是大豆膳食中重要的功能性成分，是齐墩果烷型三萜糖苷类，存在于大豆和其他一些豆科植物中[6]。离体和在体实验中都发现大豆皂甙对心血管系统具有保护作用，如通过抗氧化、降低血浆胆固醇等功能可能对机体血压产生影响[7-8]。Takahashi等[9]在自发性高血压大鼠模型中发现口服大豆皂甙Bb可以显著降低血管收缩压，离体实验中大豆皂甙Bb可以作为肾素的抑制剂，通过肾素-血管紧张素系统降低血压。但是，Kamo等[10]在对大豆皂甙的生物利用率的研究中显示，大豆皂甙被吸收进入血液循环的量低于离体实验中的有效作用浓度。由此，笔者认为大豆皂甙对机体的直接作用并不能完全解释其对心血管系统的影响。鉴于大豆皂甙首先需要经过肠道微生物群落的代谢才能被机体吸收，且大豆皂甙可抑制某些特定菌群的生长[11]，我们推测大豆皂甙也可以通过改变结肠中微生物群落组成的方式参与机体血压的调节。

本研究构建了与人类盐敏感性高血压相似的高盐饮食诱导的小鼠高血压模型[12]，然后通过饮食中添加大豆皂甙，观察和记录小鼠血压的变化，并对小鼠粪便样品进行16s rDNA扩增子测序，分析高盐摄入和大豆皂甙对小鼠结肠中微生物群落的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6J雄性小鼠，8w龄，SPF（Specific Pathogen Free）级，购自南京模式动物研究所。

1.1.2 主要试剂 正常小鼠饲料（NSD，Normal Salt Diet，0.5% NaCl）和高盐小鼠饲料（HSD，High Salt Diet，8% NaCl），南京特洛菲饲料科技有限公司;大豆皂甙Bb（Soyasaponin I），CAS 51330-27-9，纯度：HPLC，≥98%，上海源叶生物科技有限公司;粪便基因组DNA提取试剂盒（DP328-02），天根生物科技有限公司;Qubit dsDNA Assay Kit（Q328520），Life Technologies;HiFi Hot Start Ready Mix（KK2501），Kapa。

1.1.3 主要仪器 小鼠无创血压测试设备（4通道），美国IITC公司;台式高速离心机（Centrifuge 5418），Eppendorf;PCR 仪（580BR10905），Bio-rad;电泳仪（HE-120），Tanon;凝胶成像仪（2500），Tanon;Bioanalyzer（2100），Aglient;MiSeq基因测序仪，Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组和处理 所有动物实验都严格按照国家《实验动物管理条例》和《江苏省实验动物管理实施办法》相关规定进行，并得到江南大学实验动物管理与动物福利伦理委员会的允许。实验小鼠饲养在12h光照（白天）和12h黑暗（夜间）循环，温度控制在20～24℃，湿度40%～60%的屏障环境中，自由摄食和饮水。实验使用8w龄，C57BL/6J，雄性小鼠，体重22～25g，共15只。进入屏障环境后，正常饲料预饲养1w。之后随机平均分为3组：正常饮食组（NSD，n=5）;高盐饮食组（HSD，n=5）;高盐饮食+大豆皂甙组（HSD_SI，n=5）。处理：NSD组喂食正常饲料，HSD组和HSD_SI组喂食高盐饲料，持续9w，第10周开始对HSD_SI组小鼠灌胃大豆皂甙Bb[1.51mg/（kg·d）]，灌胃体积为100μL/10 g，溶剂为1%吐温80]，NSD组和HSD组灌胃等体积溶剂，持续3w。同时记录摄食、饮水、体重和血压变化。

1.2.2 剂量设计 大豆皂甙在大豆中的含量在0.1%～0.5%之间，取最低值，若成人每日摄入大豆类膳食10g，则摄入大豆皂甙的量为10mg，以成人体重为60kg，根据体表面积将人体剂量换算为小鼠剂量[13]为1.51mg/（kg·d）。

1.2.3 粪便样品收集 灌胃3w后，分别收集3组小鼠新鲜粪便，通过压迫腹腔的方法，在肛门口直接收集，每组3只（n=3），样品置于干净无菌EP管中，立即放在冰上，随后放入-80℃冰箱冷冻保存，以备后续分析。

1.2.4 基因组DNA的提取和高通量测序样品的准备 使用粪便DNA抽提试剂盒对小鼠粪便样品基因组DNA进行提取，增加添加蛋白酶K（终浓度5mg/mL）65℃孵育10min和95℃孵育10min的步骤，以使革兰氏阳性菌更充分裂解。琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度，之后无菌水稀释样品至1ng/μL。以稀释后的基因组 DNA 为模板，选择测序区域为细菌16S rDNA的V3-V4 区，使用带 Barcode 的特异引物（343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′），KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶，进行 PCR，以确保扩增效率和准确性。对PCR产物进行 Qubit 定量。根据 PCR产物浓度进行等量混样，随后上机测序。

1.2.5 原始测序数据处理 原始双端测序数据使用Trimmomatic[14]软件进行去杂，之后使用FLASH（v1.2.11）[15]软件拼接，拼接后的数据使用QIIME（version 8.0）[16]软件，根据barcode序列区分各个样品的序列数据，生成不含barcode的各样品序列文件，之后序列进行进一步去杂，去除低质量的碱基序列以及模糊碱基序列，最后采用usearch[17]软件去除嵌合体序列，统计各个样本中所含的最终序列数。

1.2.6 生物信息分析 最终得的序列使用Uparse[18]软件以97% 相似度进行可操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）[19]划分。从各OTU中挑选丰度最大的序列作为代表序列与Silva 数据[20]进行比对。比对注释采用RDP classifier Naive Bayesian[21]分类算法。之后对各样品中OTU进行多样性分析和群落结构分析。通过单因素方差分析分别对小鼠粪便微生物物种丰度在NSD组、HSD组和HSD_SI组间的差异进行显著性分析和比对，筛选出同时受高盐摄入和大豆皂甙反向调节的OTU。

2 结果与分析

2.1 动物模型构建和血压变化

如图1所示，将正常饲料换为高盐饲料后，相比于NSD组小鼠，HSD组小鼠的收缩压和舒张压都显示出上升趋势，并在第8周之后收缩压大于120mm Hg和舒张压大于90mm Hg，随后保持相对稳定，并且与NSD组小鼠收缩压和舒张压显示出显著差异，表明高盐摄入使高盐饮食小鼠血压显著升高;在第10周开始对HSD_SI组小鼠灌胃大豆皂甙，1.5mg/（kg·d），持续3w，该组小鼠的收缩压和舒张压同时显现出下降趋势，表明大豆皂甙可以缓解由高盐摄入诱导的小鼠血压升高。

同时通过3组小鼠摄食量、饮水量和体重的对比（图2），发现不同组别在摄食量和体重上没有出现明显的差异，只有饮水量在正常饮食和高盐饮食间出现明显改变，这与饲料成分除NaCl含量不同以外其他成分相同相一致。同时也说明我们的实验中所用大豆皂甙的灌胃剂量不会对小鼠的胃肠道产生明显的刺激作用，排除了可能单独由灌胃引起的炎症和体重改变对小鼠血压产生的影响。

2.2 3组小鼠粪便中菌群组成比对

对3组小鼠粪便中微生物进行了扩增子测序，OTU聚类和注释，基于OTU分类，绘制了3组小鼠粪便中菌群组成的柱状图，显示3组小鼠结肠中菌群组成具有一定差异（图3）。

Chao指数反映各样品的α多样性，是通过实际观察到的OTU数目和群落中只检测到1次和2次的OTU 数目计算，估计样品中实际存在的OTU数目，如图4所示，NSD组和HSD组样品间没有显著差异，表明相比于NSD组高盐摄入并没有使HSD组小鼠结肠微生物的α多样性发生显著改变，同样HSD组和HSD_SI组间也没有显著差异，说明饮食中大豆皂甙Bb的添加没有使小鼠结肠内菌群的α多样性发生显著改变。

PCA分析显示，3组样品间OTU的组成改变，差异反映在二维坐标轴上为距离远近。图5中HSD组样品和NSD组样品间在二维坐标轴上显示出不同分布，说明相比于NSD组高盐摄入改变了HSD组小鼠结肠中菌群OTU的组成，高盐摄入对结肠中微生物群落组成具有一定的影响;而HSD_SI组样品在坐标系里的分布介于HSD组和NSD组之间，表明大豆皂甙同样作用于肠道菌群，缓解了高盐摄入造成的部分肠道菌群组成的改变。

2.3 高盐饮食和大豆皂甙反向调节的OTU

分别通过单因素方差分析对在高盐摄入后丰度改变的OTU和在饮食中补充大豆皂甙Bb后丰度发生改变的OTU，进行了差异显著性分析。通过HSD组和NSD组间的比较，HSD组相比于NSD组有33个OTU的丰度发生了显著改变（P<0.05）;通过HSD_SI组和HSD组间比较，发现22个OTU的变化具有显著性（P<0.05）。对两次的结果进行对比，发现其中11个OTU在两次方差分析中都发生了显著改变，并且受到高盐摄入和饮食中大豆皂甙Bb添加的反向調节。8个OTU在HSD组丰度显著高于NSD组和HSD_SI组，分别属于Anaerotruncus（厌氧棍状菌属）、Christensenellaceae（克里斯滕森菌科）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Alistipes（另枝菌属）、Anaerotruncus（厌氧棍状菌属）、Ruminiclostridium_9（瘤胃梭菌属_9）和Streptococcus saliva（唾液链球菌）;3个OTU在HSD组丰度显著低于NSD组和HSD_SI组，分别属于Bacteroidales_S24-7 group（拟杆菌S24-7科）和Desulfovibrio（脱硫弧菌属）（图6）。

3 结论

大豆皂甙Bb可以显著缓解由高盐饮食造成的小鼠血压升高，同时使部分在高盐饮食后丰度升高的肠道菌的丰度降低，也会使部分在高盐饮食过程中降低的肠道菌群的丰度得到一定程度的恢复和升高，这些肠道菌群与血压的变化具有一定程度的相关性，可能参与机体血压的调节过程，可以被认为是潜在的对机体血压有影响的有害菌或益生菌。

4 讨论

膳食成分和肠道菌群与心血管疾病的关系越来越受到人们的关注，大豆皂甙作为大豆膳食中的重要功能性成分对盐敏感性高血压具有显著的调节作用，它的代谢和吸收也需要肠道菌群的充分参与并同时对肠道菌群的组成和功能产生影响。小鼠经过长时间高盐饮食诱导的高血压模型与人的盐敏感性高血压相似，所以本实验采用长期高盐摄入构建了小鼠高血压模型，并在小鼠高盐高血压模型的基础上，通过大豆皂甙灌胃证实了大豆皂甙对高盐高血压的调节作用。另外，还通过扩增子分析筛选了11个受到高盐摄入和大豆皂甙反向调节的OTU，但是它们的丰度改变对机体血压是否具有调节作用有待进一步研究。

本研究旨在更深入地了解高鹽饮食和膳食成分在高血压发生和发展过程中的作用，对《中国防治慢性病中长期规划（2017—2025年）》中提出的降低我国居民高血压等心血管相关疾病的发病率提供科学依据。◇

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Effect of Soyasaponin on Blood Pressure and Intestinal Bacteria in High-salt-diet Mice

ZHANG Guang-yuan 1，WU Xiao-li 1，ZHANG Zhi-ming 1，HE Dong-xu 2

（ 1School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China; 2 National Engineering Research Center for Functional Food，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of soyasaponin on blood pressure and intestinal bacteria in high-salt-diet mice，and to screen the target intestinal bacteria that stabilizes blood pressure，providing scientific basis for the development of new functional foods and probiotics.MethodHealthy adult male mice（n=15）were randomly assigned into 3 groups including fed with diet containing 0.5% NaCl（NSD），fed with diet containing 8% NaCl（HSD group），fed with high-salt diet for 9 weeks，gavaged with soyasaponin Bb for another 3 weeks and remain in high-salt diet（HSD_SI group）.Fresh feces from 3 groups of mice were collected aseptically，and intestinal microbiota was detected by Illumina high-throughput sequencing.Microbial diversity analysis and differential OTUs comparison were performed.ResultSoyasaponin could significantly reduce the increase in blood pressure in high-salt-diet mice.At the same time，it reduced the abundance of several OTUs that were significantly increased during the high-salt diet.These OTUs might contain harmful bacteria that raise the bodys blood pressure.In addition，it also increased the abundance of several other OTUs that reduced during the high-salt diet，these OTUs might contain potential probiotics that could lower the bodys blood pressure.ConclusionSoyasaponin may regulate blood pressure via interact with intestinal bacteria.

Keywords：soyasaponin;hypertension;intestinal bacteria

（責任编辑 李婷婷）