广东西番莲茎基腐病病原的分离及鉴定

宋晓兵　崔一平　彭埃天　凌金锋　程保平　陈霞

摘要：【目的】明确引起广东西番莲茎基腐病的病原菌，为有效防治该病害提供理论依据。【方法】采用组织分离法对广东番莲茎基腐病的病原进行分离，利用柯赫氏法则测定病原菌的致病性，光学显微镜观察病原菌分生孢子的形态学特征，测序分析病原菌的rDNA ITS序列。【结果】基于柯赫氏法则的致病性测定，证实从发病西番莲茎基部主干分离获得的病原菌对西番莲具有致病性。BLAST在线比对分析结果显示，病原菌rDNA ITS序列与多个腐皮镰孢菌菌株的相似性在99%以上。结合病原菌形态学特征、致病性测定及rDNA ITS序列分析结果，可确定引起广东西番莲茎基腐病的病原菌为腐皮镰孢菌[Fusarium solani（Mart） Sacc）]。【结论】近年来引起广东西番莲茎基腐病的病原菌为腐皮镰孢菌。防治西番莲茎基腐病需注重早期预防，提早防治;合理规划种植，加强栽培;做好冬季清园，合理疏剪。

关键词： 西番莲;茎基腐病;腐皮镰孢菌;分子鉴定;广东省

中图分类号： S436.67                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）05-1007-06

Abstract：【Objective】The aim of the study was to clarify the pathogen causing stem rot of Passiflora Linn.， and provide a theoretical basis for effective prevention and treatment of the disease. 【Method】The pathogen was obtained by ti-ssue separation method， and the pathogenicity of the pathogen was determined by Koch’s rule. The morphological characteristics of the conidia of the pathogen were observed by optical microscope， and the rDNA-ITS  sequence of the pathogen was analyzed by online BLAST. 【Result】Based on the pathogenicity measurement of  Koch’s rule， it was confirmed that the isolated bacteria from the stem stalk was pathogenic to Passiflora Linn.. The BLAST online alignment showed that the similarity between the pathogen ITS sequence and those of multiple Fusarium solani strains was over 99%. Combined with the pathological characteristics of pathogen， the pathogenicity determination and sequence analysis of ITS， the pathogen causing stem rot of Passiflora Linn. was identified as Fusarium solani（Mart） Sacc. 【Conclusion】F. solani is the pathogen that can infect the base stem of Passiflora Linn. Controlling the stem rot of Passiflora Linn. requires early prevention， planning planting， strengthening cultivation， clearing garden and rationally cutting.

Key words： Passiflora Linn.; stem rot disease; Fusarium solani（Mart） Sacc; molecular identification; Guangdong

0 引言

【研究意义】西番莲（Passiflora Linn.）又称百香果、鸡蛋果，果实具有较髙的食用和药用价值（Antognoni et al.，2007;Zeraik and Yariwake，2010），目前商业栽培的品种主要有紫果西番莲（P. edulis Sims）和黄果西番莲（P. edulis var. flavicarpa Degener），在我國广东、广西、福建、台湾和云南等省（区）均有种植（王秀荣等，2003;霍丹群等，2012）。近年来，随着西番莲规模化种植的普及，其病害问题日渐突出（严佳文等，2018）。2017—2018年在广东省德庆县大面积暴发西番莲茎基腐病，田间表现为初期茎基部出现水渍腐烂症状，随后植株逐渐枯萎、落叶，后期整株黄萎枯死，导致全园毁灭。鉴于西番莲茎基腐病对广东西番莲产业的严重危害，非常有必要对其病原菌进行分子鉴定，明确广东地区西番莲茎基腐病的病原种类，为生产上防治该病害提供科学依据。【前人研究进展】国内对西番莲茎基腐病的研究主要集中在病原鉴定、发生规律、种植栽培和化学防治等方面。郑加协等（1992）、李德福等（1993）采用传统分离鉴定法，分别将福建西番莲基腐病病原鉴定为尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum Schlecht）和腐皮镰孢菌[F. solani（Mart） Sacc]。詹儒林等（2003）采用常规鉴定法对海南琼海西番莲基腐病病原菌进行鉴定，根据形态特征和最适生长温度将病原菌鉴定为烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae Breda de Haan）。陈星等（2017）分离鉴定了广西防城港西番莲茎基腐病病原菌，结合形态学和ITS序列鉴定结果，共获得9个属43个真菌分离物，致病性试验证实病原菌为尖孢镰孢菌。目前西番莲茎基腐病的防治主要依赖杀菌剂，林泗海等（2015）建议在西番莲植株茎基部涂抹500倍液的70%甲基托布津或50%多菌灵，可有效预防和控制西番莲茎基腐病的发生;黄志巧等（2017）利用茎基部包裹浇药法测定了4种药剂对西番莲茎基腐病的防效，结果表明，65%代森锌和80%多菌灵对西番莲茎基腐病有较好的防治效果。【本研究切入点】前人研究结果表明，不同省份或地区的西番莲茎基腐病原菌有所差异，但关于广东西番莲茎基腐病原鉴定及防治措施至今未见研究报道。【拟解决的关键问题】通过组织分离法获得广东西番莲茎基腐病的病原菌，利用柯赫氏法则测定病原菌的致病性，光学显微镜观察病原菌形态特征，测序分析病原菌的rDNA ITS序列，并结合病原菌形态学特征和致病性测定确定广东省西番莲茎基腐病病原，为生产上防治西番莲茎基腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样品采集 2018年5—8月，分3次在广东省德庆县新圩镇采集西番莲茎基腐病病株。

1. 1. 2 试剂及培养基 AxyPrep基因组DNA试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司;PCR引物ITS1/ITS4由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g。

1. 2 病原菌分离纯化

采用植物病原真菌常规分离法进行病原菌分离（方中达，1998）。切取患病西番莲茎基部病健交界处的组织块，经75%酒精消毒1 min、0.1%升汞消毒2 min、无菌水漂洗3次后接种至PDA培养基，置于28 ℃恒温条件下培养。培养2～3 d待长出菌丝后，挑取菌落边缘接种至PDA培养基进行纯化，获得的纯培养物保存于PDA斜面培养基上，4 ℃保存备用。

1. 3 病原菌致病性测定

1. 3. 1 离体接种 按照柯赫氏法则进行病原菌的致病性测定。将纯化保存的病原菌活化后接种至PDA培养基上28 ℃培养5 d，用直径6 mm的打孔器打取菌丝块。取健康的西番莲茎用一次性医用针头轻轻刺伤表皮，然后将制备好的菌丝块挑取至刺伤部位，菌丝正面倒置，置于铺有3层纱布保湿的塑料密封盒内。接种发病后从病斑上再次分离病原菌。

1. 3. 2 活体接种 将纯化保存的病原菌活化后接种至PDA培养基上28 ℃培养7 d，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，用血球计数板确定孢子悬浮液浓度，制备1.0×108个孢子/mL的分生孢子悬浮液。取健康的盆栽西番莲用一次性医用针头轻轻刺伤茎基部的表皮数处，然后用手持喷雾器将制备好的分生孢子悬浮液喷施至西番莲茎基部。接种发病后从病斑上再次分离病原菌。

1. 4 病原菌形态特征观察

将病原菌接种至PDA培养基，置于28 ℃无光照条件下培养，定期观察菌落的生长情况，并记录菌落颜色、形态及生长情况;在光学显微镜下观察病原菌的菌丝和分生孢子形态。

1. 5 病原菌分子生物学鉴定

采用rDNA ITS序列分析方法对病原菌进行分子生物学鉴定。将病原菌接种至PDA液体培养基，置于28 ℃下150 r/min振荡培养3 d。灭菌滤纸过滤菌液，取适量的菌丝于灭菌研钵中，加入液氮研磨至粉末，参照Axyprep基因组DNA试剂盒说明书提取病原菌基因组DNA。利用真菌rDNA ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增。 PCR反应体系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海英骏生物技术有限公司测序。运用DNASTAR对所获得的基因序列进行比较分析，将基因序列在NCBI数据库进行BLAST比对，利用MEGA 6.0进行相应序列的同源性分析，并采用邻接法构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2. 1 病害田间症状

西番莲茎基腐病主要受害部位为离地面5～10 cm的植株茎基部，染病初期在西番莲茎基部出现褐色至深褐色病斑，然后病部皮层逐渐产生裂痕、变软、腐烂，病部组织易与木质部分离。染病后期茎部病斑横向扩展环绕整个茎干，植株的枝蔓和叶片出现黄化、凋萎、落叶，果实逐渐萎缩、干瘪，最后植株完全枯萎直至死亡（图1）。

2. 2 病原菌致病性测定结果

分3次采集发病西番莲茎基部主干，在实验室对病部进行分离，均分离到同一形态真菌，显微镜观察发现典型的镰孢霉属真菌分生孢子，初步判断为镰孢霉属真菌引起的病害。菌株离体接种致病性测定结果显示，接种1 d后，接种部位开始出现水渍状病斑，随后病斑沿茎部呈条形扩展，最后整条枝條腐烂（图2）。发病后从病斑上再次分离，获得与接种病原菌相同的分离菌株。

菌株活体接种致病性测定结果显示，接种40 d后，接种部位开始出现褐色病斑;接种50 d后病斑环绕茎基部，植株开始落叶;接种60 d后植株大部分叶片凋落，濒临枯死（图3）。发病后从病斑上再次分离获得与接种病原菌相同的分离菌株。

2. 3 病原菌形态特征

病原菌在PDA培养基上于28 ℃无光照条件下培养，其菌落圆形或椭圆形，初呈白色，后转浅灰色，气生菌丝薄绒状，间有土黄色分生孢子座（图4-a）。光学显微镜下可见典型的镰孢霉属真菌分生孢子，病原菌可产生大型分生孢子和小型分生孢子，大型分生孢子呈镰刀形，两端较钝，顶孢稍弯，具2～4个隔膜，壁较薄，大小为23.8～65.3 μm×3.2～5.6 μm;小型分生孢子呈卵形或椭圆形，大小为8.3～14.4 μm×2.5～3.8 μm（图4-b）。

2. 4 病原菌分子鉴定结果

利用通用引物ITS1/ITS4可扩增获得长度为542 bp的片段。将测序所得序列进行BLAST在线比对分析，发现分离获得的西番莲茎基腐病菌（F. solani strain XFL）的rDNA ITS序列与NCBI数据库中多个腐皮镰孢菌菌株对应序列（登录号KF751072、KM277969、JX435198和KM229694等）的相似性高达99%。基于rDNA ITS序列相似性构建的系统发育进化树（图5）显示，西番莲茎基腐病菌与腐皮镰孢菌（F. solani）的多个分离物聚为一个分支，而尖孢镰孢菌（F. oxysporum）菌株（登录号KC478639）和禾谷镰孢菌（F. graminearum）菌株（登录号MG670538）则聚为另一分支。通过形态特征观察、分子生物学鉴定和致病性测定，可将分离获得的西番莲茎基腐病菌鉴定为腐皮镰孢菌[F. solani（Mart） Sacc]。

3 讨论

镰孢霉属（Fusarium）又称镰刀菌属，是真菌中难鉴定但具有经济价值的属，该属是由Link以粉红镰刀菌（F. roseum Link）为模式种建立（王桂清和马迪，2017;高芬等，2018）。由于镰孢霉属真菌的多型性和易变异性，其分类鉴定仍然是真菌研究的重要难题之一（杜宾，2017）。镰孢霉属真菌的形态较复杂，以形态学为基础建立的分类系统难以进行准确分类鉴定，单凭形态学特征的鉴定结果存在不确定性。采用分子生物学及测序技术，使DNA成为区分物种、变种和地理株的有效手段，为镰孢霉属真菌鉴定提供了更科学的方法（王世伟等，2018）。DNA条形码技术作为一种新兴的分子检测技术已得到快速发展，越来越多学者利用DNA条形码技术开展对镰孢霉属真菌分类系统发育的研究（Hebert et al.，2004;雷娅红等，2016），尤其是多种基因位点如ITS和翻译延伸因子（Nuclear translation elongation factor-1α，EF-1α）已广泛应用于镰孢霉属及种间的鉴定（曹雪梅等，2014）。本研究将形态学和分子生物学鉴定相结合，通过病原菌形态特征观察、致病性测定和分子生物学鉴定，将分离获得的西番莲茎基腐病原菌鉴定为腐皮镰孢菌，与李德福等（1993）的报道一致，为该病害的防治提供了理论依据。

对于镰孢霉属真菌引起的植物真菌病害，由于缺少有效的防治药剂，一直以来都是防治难题，而且果园规模化种植单一品种又加剧了病害的扩散蔓延。目前关于西番莲茎基腐病的防治研究较少，防治技术也较单一，主要依赖杀菌剂防治（林泗海等，2015;黄志巧等，2017），以及选用抗病品种、加强田间管理、增施有机肥等（卢桂玲和黄英晴，2017）。郑继华（2000）调查发现，利用刷干预防的措施可有效防治西番莲茎基腐病。当前，尚缺乏西番莲抗病育种、果园间作、高效栽培等方面的深入研究。每年5—7月是广东西番莲茎基腐病的发病高峰期，病原菌主要通过伤口从植株茎基部侵入，造成果园大面积暴发病害。西番莲茎基腐病的防治应以预防为主，提早防治，主要措施：冬季清除病原，冬季落叶后至萌芽前用石硫合剂全园喷施;加强栽培管理，增施有机肥和生物菌肥，增加土壤通透性;合理疏剪枝叶，保持果园通风透光，改善果园阴蔽潮湿环境;早期药剂防治，可选择多菌灵、恶霉灵、咯菌腈和甲基托布津等，刮除病部后涂抹药剂。

大面积种植单一品种会对病原菌产生定向选择压力，导致某些病害的流行与危害，而品种混合种植可抑制病害发展，利用种内生物多样性控制病害的研究日益得到广泛关注（陈企村等，2009;黄冲等，2010;姜延涛等，2015）。许韬等（2014）研究田间混播种植26个小麦品种组合的抑病效果，其中对小麦白粉病有防治效果的组合占73.08%，相对防效为1.23%～56.65%。据笔者调研发现，广东省紫果西番莲发生茎基腐病较重，黄果西番莲发病相对较轻，可能与不同品种的抗病性存在差异有关。建议在大面积推广种植西番莲的同时，考虑不同品种混种，以减少病害大暴发的概率。

4 结论

基于病原菌形态特征观察、分子生物学鉴定和致病性测定，确定广东西番莲茎基腐病原菌為腐皮镰孢菌[F. solani（Mart） Sacc]。目前尚无防治西番莲茎基腐病的有效药剂，需注重早期预防，提早防治;合理规划种植，加强栽培;做好冬季清园，合理疏剪;开展抗病育种、果园间作、高效栽培等研究。

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（責任编辑 麻小燕）