构建遗传修饰小鼠过程中外源核酸传递方法的研究进展

赵巧雪 黄镇 王玮琪

摘 要：传统构建遗传修饰小鼠的方法有2种，一种是采用显微注射技术将特定核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎体内，另一种是将小鼠的胚胎干细胞导入到囊胚中。较为广泛应用的是采用显微注射技术将特定核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎体内，即核酸传递方法，该方法可以通过注射方法、转染方式及性腺组织介导进行核酸传递。综述构建遗传修饰小鼠过程中的核酸传递方法，包括原核注射、囊胚显微注射、受精卵核酸电转染、输卵管核酸电转染、精子介导的基因转移、卵巢组织注射等方法的研究进展，并对核酸传递方法的进一步利用和发展方向进行展望。

关键词：遗传修饰小鼠; 核酸物质传递; 显微注射; 电转染; 基因编辑

Abstract： There are two traditional methods to build the genetically modified mouse model， one method is to use the microinjection to transfer specific nucleotide sequence into the fertilized eggs or embryos of mouse， while the other is to introduce the embryonic stem cells of mouse into the blastocyst. The first method， that is， nucleic acid transferring method， is widely used which can transfer the nucleic acid through injection method， transfection method and gonadal tissue mediate. The research progress of nucleic acid transferring method in the process of building genetically modified mouse model was summarized including pronucleus injection， blastocyst microinjection， the nucleic acid electrotransfection of fertilized eggs， the nucleic acid electrotransfection of oviduct， sperm-mediated gene transfer， ovarian tissue injection， etc. Then， the further usage and development direction of nucleic acid transferring method were prospected.

Key words： Genetically modified mouse;Nucleic acid transfer;Microinjection;Electrotransfection;Gene editing

傳统的构建基因遗传修饰小鼠方法是对体外培养的小鼠胚胎干细胞进行基因遗传修饰，通过显微操作注射到囊胚中，最终在得到的嵌合体小鼠中进行筛选，得到基因遗传修饰稳定遗传的小鼠[1-3]。但该技术需要长时间筛选胚胎干细胞的单克隆细胞株，并且嵌合体小鼠的筛选周期较长。近年来，随着基因编辑技术的发展，对小鼠的基因组进行基因编辑变得简单和快速，同时，将核酸序列传递到小鼠受精卵或胚胎内的方法也得到发展，构建基因修饰动物的方法更加多元化。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）及CRISPR/Cas9系统（CRISPR/Cas9 system）等[4-6]，均可以在靶位点处切割DNA，导致DNA双链断裂（double strand breaks，DSBs），并通过DNA损伤修复的两条途径——非同源末端连接（non-homologous ending-joining，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HR）实现对目的基因序列的敲除或插入[7]，从而对基因序列进行定点编辑。其中，CRISPR/Cas9系统因设计简单，操作成本低，被广泛应用于构建基因修饰动物[8]。该技术是将Cas9蛋白和sgRNA （mRNA或者质粒元件）传递到小鼠受精卵中，进行基因组的编辑，从而获得遗传修饰小鼠[9]。目前，关于如何将Cas9蛋白和sgRNA的核酸传递到受精卵中是影响高效构建遗传修饰小鼠的关键步骤。当前，原核显微注射是应用最广泛的方法，该方法是将核酸通过特制的玻璃针注射到小鼠受精卵的细胞核中。由于其操作过程需要昂贵的显微操作仪器，并且对操作人员的熟练程度要求极高[10]，因此，在对核酸高效传递到小鼠的受精卵或早期胚胎研究过程中，先后出现了多种将核酸传入小鼠受精卵或胚胎中的新方法，包括注射、DNA转染、性腺组织介导等方法，新的研究方法取得了不错的效果，但核酸传递效率有待进一步提高。本文对构建遗传修饰小鼠过程中的核酸传递方法进行综述，分析各方法的优缺点，以期为构建其他模式动物的遗传修饰模型提供理论基础。

1 通过注射方法进行核酸传递

1.1 原核注射

原核注射（pronuclear injection）是将外源基因通过显微操作技术注射到小鼠受精卵的原核中，使得含有目的基因的DNA片段随机整合到小鼠基因组中，从而产生遗传修饰小鼠[10]。原核注射技术自从面世以来，一直是研究热点。近年来，随着ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas9等新型基因编辑系统的出现，研究者们将基因编辑系统与原核注射技术相结合，构建基因敲除或敲入的遗传修饰小鼠。2010年Carbery等[11]结合了ZFNs与显微注射技术，成功构建了第1只基因敲除小鼠，2013年Sung等[12]首次将TALENs和显微注射技术相结合成功构建基因条件性敲除小鼠，Yang等[13]利用CRIPSR/Cas9技术和显微注射技术成功构建了第1只基因条件性敲除小鼠，2013年李劲松等[14]将sgRNA和Cas9蛋白注入患有白内障小鼠的受精卵中后，发现有1/3新生小鼠的白内障被治愈，并且能稳定遗传到下一代，表明白内障遗传疾病可以得到根治。2015年Liang等[15]首次将CRISPR-Cas9技术用于人类胚胎基因编辑。因此，原核注射目前仍然是构建遗传修饰小鼠主要的方法。虽然原核注射与基因编辑技术结合相比于传统基于胚胎干细胞的构建遗传修饰小鼠方法简单，但所需设备昂贵，对试验人员操作技术熟练程度要求极高。

1.2 囊胚显微注射

囊胚显微注射法是直接将核酸物质注射到囊胚腔中，利用囊胚细胞随机摄取外源DNA的特性，使得外源DNA随机插入到囊胚细胞的基因组中，进一步通过囊胚移植获得转基因的后代。1974年Jaenisch和Mintz等[16]第1次采用囊胚显微注射法将猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）的DNA载体通过显微注射技术注射到囊胚腔中，成功的转染到滋养外胚层和一部分内细胞团中，再将囊胚移植入代孕小鼠体内，收获子代嵌合体小鼠。结果发现，将近有40%的子代小鼠的基因组成功整合了外源DNA，但外源DNA是否能传递到下一代小鼠并没有报道。该技术没有被广泛使用，主要原因是只有部分的囊胚内细胞团能摄取外源DNA，进行囊胚移植后即使能获得转基因后代，也需要经过长期筛选过程;同时，该方法还需要应用到显微操作技术，且要求试验人员对囊胚显微注射及囊胚移植入代孕母鼠子宫技术比较熟练。

2 通过转染方法进行核酸传递

2.1 受精卵核酸电转染

受精卵核酸电转法（zygote electroporation of nucleases，ZEN）是利用电穿孔（electroporation）技术将外源基因传递到动物受精卵，并将受精卵移植到代孕动物体内获得转基因动物的方法。2002年Grabarek等[17]首次证明了可以利用电穿孔技术将核酸物质高效传递入小鼠受精卵中。但该方法的主要难点是受精卵的透明带阻碍了核酸物质的有效转入，尽管去透明带后提高了转染效率，但透明带对于受精卵着床及发育是至关重要的，去透明带会导致受精卵成功发育成为个体的概率降低[18]。随后，多位研究者提出了在电转染前，利用酸性台式液弱化透明带的策略，在提高转染效率的同时也保证小鼠胚胎发育过程的正常进行[18-20]。2002年Peng等[21]将弱化透明带策略应用于利用电穿孔技术将Oct4-特异性shRNA表达质粒传递到小鼠受精卵的过程中，成功下调小鼠胚胎中Oct4的表达。

2014年Kaneko等[22]首次成功利用电穿孔仪器（型号：NEPA21，NEPA GENE）对大鼠受精卵进行基因编辑，将TALENs或CRISPR/Cas9基因编辑组件在特定脉冲条件下传递到受精卵中，最终有73%的子代大鼠基因组发生了遗传修饰。相比于显微注射只能对受精卵依次注射，采用电穿孔技术可以一次处理100个以上的受精卵，而且不需要对受精卵进行弱化透明带处理。之后，陆续有研究者利用不同于NEPA21的仪器通过电穿孔技术进行基因编辑组件的传递，2015年Hashimoto等[23]将CRISPR/Cas9与电转染技术结合，成功在小鼠胚胎中实现基于电穿孔技术的外源基因敲入，2015年Qin等[24]利用电穿孔仪器ECM830将Cas9蛋白和sgRNA以及外源DNA模板一起通过电转的方法传递到小鼠受精卵中，并结合体外移植技术将受精卵移植入代孕母鼠体内成功收获了外源基因敲入小鼠。之后，Wang等[25]成功利用ZEN技术构建了敲入LoxP序列的条件性基因打靶小鼠。这种将基因编辑系统与电转相结合的方法在核酸传递过程中对设备的要求简单而且操作方便，在大多数实验室构建转基因小鼠过程中得到了广泛应用，未来更多实验室将会采用的核酸传递技术。

2.2 输卵管核酸电转染

输卵管核酸电转（genome-editing via oviductal nucleic acids delivery，GONAD）是将DNA注射到怀孕小鼠输卵管中受精卵所在的壶腹部，再对壶腹部进行电转化，将核酸传递到小鼠受精卵内，从而收获转基因动物。1998年Relloso等[26]首次将携带β-半乳糖苷酶（Beta-galactosidase，β-Gal）报告基因的脂质体注入到10只小鼠输卵管腔中，2～5 d后将小鼠输卵管进行组织形态学分析，发现其中9只小鼠输卵管上皮细胞呈现β-Gal阳性。2005年Sato等[27]将质粒DNA注入怀孕0.4 d的小鼠输卵管的壶腹部，然后利用电转仪对整个输卵管进行电转，最终有43%概率成功将质粒DNA传递到输卵管的上皮细胞内;但是质粒DNA不能成功电转入位于輸卵管壶腹部的受精卵中，这可能是由于卵丘细胞阻碍DNA转入受精卵。2012年Sato等进一步尝试对怀孕1.6 d的母鼠进行试验，此时卵丘细胞已经与受精卵分离。研究结果表明，用EGFP-N1质粒进行电转1 d后，4～8个胚胎发出绿色荧光，但其后代中外源DNA并未整合在基因组上[28]。2015年Takahashi等将CRISPR/Cas9系统与输卵管核酸电转结合，利用T820电转仪将Cas9蛋白和sgRNA注射至怀孕1.6 d的母鼠输卵管壶腹部，并施加特定的脉冲，发现25只子代转基因小鼠中只有7只突变体[29]。该研究证明了体内对着床前胚胎进行基因编辑是可行的。

输卵管核酸传递基因编辑技术是目前对着床前受精卵进行基因编辑方法中最为简单方便的方法，该技术不需要一系列复杂的步骤，也无需昂贵的显微注射系统和熟练的受精卵显微注射技术，未来能广泛应用于常规实验室进行遗传修饰小鼠的制备。

3 通过性腺组织介导的核酸传递方法

3.1 精子介导的基因转移

精子介导的基因转移（Sperm-mediated gene transfer，SMGT）是在体外将外源DNA整合到精子后通过体外受精（in vitro fertilization，IVF）收获转基因子代的方法。1989年Lavitrano等[30]首次将小鼠的精子从尾睾中分离出来并与质粒共孵育，结果表明，精子能与质粒DNA结合。当用结合质粒DNA精子与卵子进行IVF后，这些外源DNA有一定的概率被整合到受精卵的基因组上。利用精子介导的基因传递方法构建转基因动物简单，并且不需要显微注射设备。1998年Maione等[31]采用精子介导的基因转移方法在小鼠中进行了大规模验证试验，共收获130只转基因后代，占收获小鼠总数的7.4%。2002年Lavitrano等[32]在猪中进行精子介导的基因转移，获得80%的转基因猪，其中有64%具有遗传稳定性。在国内，2006年沈伟等[33]采用DMSO精子介导技术将增强绿色荧光蛋白（enhanced green flurorescent protein，EGFP）转移至小鼠精子体内，获得的转基因小鼠阳性率高达41.7%。2007年，董焕声等[34]利用精子介导技术将绿色荧光蛋白（green flurorescent protein，GFP）基因转移到小鼠精子内，体外受精后进行体外培养，表达GFP胚胎的阳性率为4.7%，验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性。若CRISPR/Cas9基因编辑系统与精子介导技术手段结合一旦成功，相信精子介导的基因转移会得到更广泛的应用[35]。

3.2 卵巢組织注射

卵巢组织注射是通过病毒载体或脂质体转染将外源DNA传递进入卵巢细胞的技术。2001年Gordon等[36]尝试将腺病毒注射到小鼠卵巢髓质中感染卵巢细胞和卵母细胞，但发现即使加大病毒剂量也未发现被感染的卵母细胞。2004年Shimizu等[37]将包装有外源质粒DNA的脂质体注射到猪卵巢髓质，该质粒编码猪生长分化因子9（growth differentiation factor-9，GDF-9），GDF-9是属于转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族的生长刺激因子，特异地在未成熟卵泡中表达。结果显示，注射后的未成熟卵泡、次级和三级卵泡数量增加，研究人员认为该结果是GDF-9在卵巢中过表达产生的，但并未阐述细节。2003年Sato等[38]尝试通过在小鼠卵巢内注射传递含有LacZ基因的质粒到卵巢中，之后进行体内电转。对电转后的卵巢进行X-gal染色，结果显示8%～60%的卵泡带有LacZ报告基因，部分包围有1～2层卵泡的卵母细胞也呈现LacZ活性染色阳性。2007年Yang等[39]用相似的方法将DNA注射到小鼠卵巢中，进而使DNA进入卵母细胞中，在激素刺激下排卵后受精，发现子代转基因小鼠中携带有外源DNA。这些研究证实了通过卵巢注射构建转基因小鼠的可能性，但是如何同时将外源基因引入卵巢和卵母细胞还有待进一步研究。

4 小结与展望

综上所述，在将外源核酸传递到小鼠的受精卵或胚胎中构建遗传修饰小鼠的不断探索及研究过程中，通过性腺组织进行核酸传递是最容易操作的方法，该方法虽然能得到一定概率的遗传修饰小鼠，但是得到的遗传修饰小鼠并不能稳定地将遗传修饰传递到子代。原核显微注射技术是目前最为广泛使用的用于构建遗传修饰小鼠的核酸传递方法，但该技术需要昂贵的显微操作系统，且需要操作人员具有相当熟练的原核显微注射和体外移植受精卵技术，普通实验室难以在短时间内方便熟练掌握。近年来，通过电转染将外源核酸DNA和基因编辑系统的组件导入到小鼠受精卵内的方法广泛开展，尤其是在体内对受精卵的输卵管进行电转从而将核酸传递到受精卵内的方法正在不断进步，该方法相对简单，并且避免了昂贵的显微操作系统的使用及对试验人员的技术要求高，具备广阔的应用前景。总之，在构建遗传修饰小鼠过程中，生物学家对如何提高核酸传递到受精卵的效率还在不断地研究与探索，希望本文的论述可为开发新的方法提供理论研究基础。

参考文献：

[1]宋震涛，李秋棠，尚克刚，等.从早期胚胎多能干细胞生成的嵌合鼠[J].遗传学报，1993，20（6）：499-503.

[2]CAPECCHI M R.Gene targeting in mice：functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century[J].Nature Reviews Genetics，2005，6（6）：507-512.

[3]GARDNER R L.Mouse chimeras obtained by the injection of cells into the blastocyst[J].Nature，1968，220：596-597.

[4]贾良杰.CRISPR/Cas9基因组靶向编辑技术综述[J].中国医药导报，2014，11（22）：154-156.

[5]URNOV F D，REBAR E J，HOLMES M C，et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases[J].Nature Reviews Genetics，2010，11（9）：636-646.

[6]JOUNG J K，SANDER J D.TALENs：a widely applicable technology for targeted genome editing[J].Nature reviews Molecular Cell Biology，2013，14（1）：49-55.

[7]黄敏，缪泽鸿，丁健.DNA双链断裂损伤修复系统研究进展[J].生理科学进展，2007，38（4）：295-300.

[8]CONG L，RAN F，COX D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339：819-823.

[9]ZHANG X，LIANG P，DING C，et al.Efficient Production of Gene-Modified Mice using Staphylococcus aureus Cas9[J].Scientific Reports，2016，6：32565.

[10]GORDON J W，SCANGOS G A，et al.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA[J].P Natl Acad Sci USA，1980， 77（12）：7380-7384.

[11]CARBERY I D，JI D，HARRINGTON A，et al.Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases[J].Genetics，2010，186（2）：451-459.

[12]SUNG Y H，BAEK I J，KIM D H，et al.Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting[J].Nature Biotechnol，2013，31（1）：23-24.

[13]YANG H，AL E.One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，154（6）：1370-1379.

[14]Cell Stem Cell發表CRISPR-Cas9技术介导的遗传疾病基因治疗[J].生命的化学，2013（6）： 714-716.

[15]LIANG P，XU Y，ZHANG X，et al.CRISPR/Cas9 mediated gene editing in human tripronuclear zygotes[J].Protein and Cell，2015，6（5）：363-372.

[16]JAENISCH R，MINTZ B.Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA[J].P Natl Acad Sci USAP，1974，71（4）： 1250-1254.

[17]GRABAREK J B，PLUSA B，GLOVER D M，et al.Efficient delivery of dsRNA into zona-enclosed mouse oocytes and preimplantation embryos by electroporation[J].Genesis，2002，32：269-276.

[18]MODLINSKI J A.The role of the zona pellucida in the development of mouse eggs in vivo[J].J Embrgol Exp Morphol，1970，23（3）：539-547.

[19]RANKIN T L，O′BRIEN M，LEE E，et al.Defective zonae pellucidae in Zp2-null mice disrupt folliculogenesis，fertility and development[J].Development，2001，128（7）：1119-1126.

[20]BRONSON R，MCLAREN A.Transfer to the mouse oviduct of eggs with and without the zona pellucida[J].Journal of reproduction and fertility，1970，22（1）：129-137.

[21]PENG H，WU Y，ZHANG Y.Efficient delivery of DNA and morpholinos into mouse preimplantation embryos by electroporation[J].Plos ONE，2012，7（8）：e43748.

[22]KANEKO T，SAKUMA T，YAMAMOTO T，et al.Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos[J].Scientific Reports，2014，4：6382.

[23]HASHIMOTO M，TAKEMOTO T.Erratum：Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing[J].Scientific Reports，2015，5：12658.

[24]QIN W，DION S，KUTNY P，et al.Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Mice by Zygote Electroporation of Nuclease[J].Genetics，2015，200（2）：423-430.

[25]WANG W，KUTNY P M，BYERS S L，et al.Delivery of Cas9 Protein into Mouse Zygotes through a Series of Electroporation Dramatically Increases the Efficiency of Model Creation[J].Journal of Genetics and Genomics，2016，43（5）：319-27.

[26]RELLOSO M，ESPONDA P.In vivo gene transfer to the mouse oviduct epithelium[J].Fertility and sterility，1998，70（2）：366-368.

[27]SATO M.Intraoviductal introduction of plasmid DNA and subsequent electroporation for efficient in vivo gene transfer to murine oviductal epithelium[J].Mol Reprod Dev，2005，71（3）：321-330.

[28]SATO M，AKASAKA E，SAITOH I，et al.In vivo gene transfer in mouse preimplantation embryos after intraoviductal injection of plasmid DNA and subsequent in vivo electroporation[J].Syst Biol Reprod Med，2012，58（5）：278-287.

[29]TAKAHASHI G，GURUMURTHY C B，WADA K，et al.GONAD：Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery system：a novel microinjection independent genome engineering method in mice[J].Scientific Reports，2015，5：11406.

[30]LAVITRANO M，CAMAIONI A，FAZIO V，et al.Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs：genetic transformation of mice[J].Cell，1989，57（5）：717-723.

[31]MAIONE B，LAVITRANO M，SPADAFORA C，et al.Sperm-mediated gene transfer in mice[J].Mol Reprod Dev，1998，50（4）：406-409.

[32]LAVITRANO M，BACCI ML，FORNI M，et al.Efficient Production by Sperm-Mediated Gene Transfer of Human Decay Accelerating Factor （hDAF） Transgenic Pigs for Xenotransplantation[J].P Natl Acad Sci USA，2002，99（22）：14230-14235.

[33]SHEN W，LI L，PAN Q，et al.Efficient and simple production of transgenic mice and rabbits using the new DMSO-sperm mediated exogenous DNA transfer method[J].Mol Reprod Dev，2006， 73（5）：589-594.

[34]董焕声，房勇卫，李兰，等.精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达[J].生物工程学报， 2007，23（3）：535-539.

[35]LAVITRANO M，STOPPACCIARO A，BACCI M L，et al.Human decay accelerating factor transgenic pigs for xenotransplantation obtained by sperm-mediated gene transfer[J].Transplantation Proceedings，1999，31（1-2）：972-974.

[36]GORDON J W.DIRECT.Exposure of Mouse Ovaries and Oocytes to High Doses of an Adenovirus Gene Therapy Vector Fails to Lead to Germ Cell Transduction[J].Molecular Therapy，2001，3（4）：557-564.

[37]SHIMIZU T，MIYAHAYASHI Y，YOKOO M，et al.Molecular cloning of porcine growth differentiation factor 9 （GDF-9） cDNA and its role in early folliculogenesis：direct ovarian injection of GDF-9 gene fragments promotes early folliculogenesis[J].Reproduction，2004，128（5）：537-543.

[38]SATO M，TANIGAWA M，KIKUCHI N，et al.Efficient gene delivery into murine ovarian cells by intraovarian injection of plasmid DNA and subsequent in vivo electroporation[J].Genesis，2003，35（3）：169-174.

[39]YANG S Y，WANG J G，CUI H X，et al.Efficient generation of transgenic mice by direct intraovarian injection of plasmid DNA[J].Biochem Bioph Resco，2007，358（1）：266-271.

（責任编辑：林玲娜）