CRISPR基因编辑技术发展与应用前景

陈亦儿

摘 要：基因编辑技术是用于编辑改造生物DNA的技术。本文主要介绍的是目前最常用的CRISPR技术。该技术改造于细菌及古细菌防止外源DNA入侵的特异性免疫系统，其中Cas9型最为简便实用。随着CRISPR技术的逐渐完善，其高效、简便、快捷的优点使其在基础研究，临床医学，农业生产中都得到了广泛应用。只要能正确合理的利用，CRISPR将极大地推动生命科学的发展与进步。

关键词：CRISPR；基因编辑；医学研究；农业生产

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）20-0189-02

1 CRISPR基因编辑技术

基因编辑技术是用于编辑改造生物DNA的技术。目前ZFN（zinc-finger nucleases，锌指核酸酶）技术、TALEN （transcription activator-like effector nucleases，转录激活样效应因子核酸酶）技术和CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，成簇规律间隔短回文重复）技术并称为三大基因编辑技术。其中，新兴的CRISPR技术相较TALEN技术和ZFN技术更简易、更灵活、更高效，成本也更低，被认为是目前最有发展前景的基因编辑技术。

1987年Nakata研究组发现在位于IAP基因的3端存在碱基高度同源序列重复出现，引起生物科学界的广泛关注。不久后，Jansen实验室发现这种新型的DNA序列仅存在于细菌及古细菌中，并将这种序列称为成簇规律间隔短回文重复，即CRISPR。他们将临近CRISPR位点的基因命名为CAS（CRISPR-associated）基因。2012年，科学家们通过体外实验证明了成熟的crRNA（CRISPR-derived RNA）指导CAS9蛋白在目标DNA上引起双链断裂。2013年，CRISPR/Cas系统逐步应用在基因编辑中。

2 CRISPR/Cas9系统原理

CRISPR/Cas系统主要由两个部分组成：执行识别功能的前导序列与CRISPR簇，和执行切割整合功能的Cas蛋白。CRISPR-Cas系统对外来DNA序列进行识别主要依靠CRISPR基因片段。CRISPR序列通常由21bp-48bp较短的、保守的重复序列（repeats）组成，其序列由两个间隔序列（spacer）隔开。在不同物种中，因为发挥作用的方式不尽相同，CRISPR系统被分为三类：TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ。

目前最常用的基因敲除技术——CRISPR/Cas9属于TypeⅡ。Cas9基因编码的Cas9蛋白是一种非特异性CRISPR结合核酸内切酶，该蛋白具有核酸酶的两个结构域，因此可以分别切割DNA的两条单链。当外源DNA侵入细胞时，前导序列会作为启动子引导CRISPR序列转录出两种RNA：pre-crRNA（pre-CRISPR-derived RNA）和tracrRNA（trans-acting crRNA）。tracrRNA由重复序列转录而成，具有发卡结构，而pre-crRNA则由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子。tracrRNA通过碱基互补配对与pre-crRNA的重复序列部分结合，而后Cas9蛋白与tracrRNA结合形成Cas9/tracrRNA/crRNA复合物。该复合物将扫描整个外源DNA，识别与crRNA碱基互补的原间隔序列，而后crRNA就会与原间隔序列DNA的一条单链以碱基互补配对的方式杂交，形成R环。这时，Cas9蛋白的RuvC限制酶将剪切外源DNA分子未与crRNA结合的非互补链，而其HNH酶将剪切crRNA的互补链。这样，外源DNA双链断裂，目的基因就会被敲除。如图1所示。

3 CRISPR技术优势

CRISPR技术在近年来突飞猛进，与较早的两项基因编辑技术相比，CRISPR技术相对简单、构建速度快，成本更低。

相比于ZFN技术，CRISPR技术更加高效。ZFN在对猪的Ppar-γ基因的打靶活性只有4%，对GGTA1基因的打靶效率仅为1%，而对IL2RG 基因的更低，仅为0.5%。以此可以看出，ZFN技术的打靶效率相对较低。而利用CRISPR技术对猪的vWF基因进行基因敲除，单等位基因的敲除效率高达68%，双等位基因的敲除效率也达到37%。对猪的其他基因，例如BMP15基因，基因敲除效率也可达到20%以上。同时，CRISPR/Cas9与ZFN造成的基因突变作用效果相似。虽然TALEN技术和CRISPR/Cas技术在设计原理上都相对简单，但相比于TALEN技术，CRISPR技术更加简便、快捷，这主要体现在体系构建过程中。在构建过程中，TALEN体系大约需要20个重复序列通过分子克隆或TALE重复组装方法定向连接，载体构型庞大，操作繁琐。而CRISPR体系的Cas9蛋白和gRNA骨架对于任何靶基因的操作都可以共享，针对特定基因只需要在现有体系基础上变动20或30个碱基的向导序列即可实现，且容易合成获得。尽管TALEN技术的特异性略高于CRISPR技术，但通过在选择CRISPR/Cas9切割位点时对全基因组序列进行全面的分析，可降低脱靶效率。

4 CRISPR技术应用

隨着CRISPR技术的逐渐完善，与CRISPR技术有关的实际应用也在不断发展。

医学研究方面，以CRISPR/Cas9技术为基础建立的基因编辑模式已经非常成熟。例如利用Cas9基因敲入技术得到的患肺腺癌小鼠模型，该模型能够体现多基因共同作用对肺癌表型的影响，更准确地反应癌症发生的机制和疾病的表型，在生物学和疾病建模中得到广泛应用；通过培育酪氨酸酶基因敲除型猪和PARK2、PINK1双基因敲除型猪建立的人类白化病和帕金森综合症两种猪模型，为人类异种器官移植的研究起到了推动作用。在病毒感染疾病治疗中，利用CRISPR技术将HIV病毒的主要攻击对象——人体免疫T细胞上的HIV-1病毒移除，能够使HIV无法进一步感染其他细胞，这使根治艾滋病成为可能。在治疗遗传性疾病的应用中，利用CRISPR系统去除一个可引起眼睛中感光细胞缺失的基因突变，或可以治疗视网膜色素变性，以恢复遗传性视网膜色素变性患者的视力。

农业生产方面，CRISPR技术用于建立作物调控体系，增强农作物的产量。利用CRISPR/Cas9技术对粳稻zhonghua11的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1这4个与产量相关的基因进行定点编辑，4个基因的突变效率分别为42.5%、67.5%、57.5%和27.5%，总体突变效率较高。并且第二代中Gn1、DEP1和GS3基因发生突变的水稻植株分别提高了穗粒数、密穗数和千粒重，增加了该水稻品种的产量。此外，CRISPR技术在增强家畜抗病方面发挥了巨大的作用。CD163基因被认为是猪蓝耳病病毒的受体基因，CD1D是一类抗原呈递因子。利用CRISPR/Cas9技術分别敲除猪的这两个基因，获得其基因编辑型猪。后续研究表明，该种基因编辑猪在接受蓝耳病毒株后未表现出明显的临床症状，能够有效地抵抗蓝耳病病毒感染，而7头对照猪全部表现出典型的蓝耳病临床症状。蓝耳病是养猪业在全球范围内危害性最高的传染病之一，通过敲除CD163和CD1D基因获得基因突变猪种，能够有效地减少蓝耳病造成的巨大经济损失。

5 总结与展望

CRISPR/Cas9技术简便、易操作、效率高、成本低，自问世以来就有着广大应用前景。通过CRISPR技术，能够更简易地编辑基因，从而获得具有目的性状的生物。在医学方面，CRISPR技术或能有效地治疗遗传病，如将患病胚胎的部分胚胎干细胞取出进行基因编辑，移除感病基因，再将基因编辑细胞注射回胎儿的囊胚腔中进行治疗。将CRISPR技术应用于编辑经济生物的基因，使生物产品增产，能够增加社会经济效益。因此，充分发挥CRISPR技术的积极作用，将给人类的生产生活带来福音。

而美中不足的是，CRISPR系统存在一定的脱靶概率，操作过程中可能发生编辑错误。若在基因治疗时发生难以立即察觉的编辑错误，将有可能对患者的健康甚至生命造成威胁。为降低靶效应带来的不良影响，目前采用诱导Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域失活，形成切割单链的Cas9蛋白的方法。另一方面，由于CRISPR技术编辑功能过于强大，若不加节制的开发使用，或将引发伦理，社会安全等严重问题。对此应建全相关法律体系，限制CRISPR技术的滥用，引导该技术向正确的方向发展。

CRISPR技术有着其它基因编辑技术难以替代的优点。若正确地利用CRISPR技术，不断对其进行改造使之更加简易可控，将会极其有效地推动生命科学和医学等领域的发展和进步。

参考文献

[1]吴金青，梅瑰等.应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率[J].遗传，2015，37（01）：55-62.

[2]姜泽群，杨烨.CRISPR/Cas技术在生物医药研究中的应用[J].药物生物技术，2016，23（05）：412-416.

[3]唐秀英，王会民等.CRISPR/Cas9系统在水稻基因组编辑中的应用[J].分子植物育种，2017，15（03）：895-902.

[4]幸宇云，杨强，任军.CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用[J].遗传，2016，38（03）：217-226.