杂交兰无菌播种及根状茎培养技术研究

林榕燕 陈艺荃 林兵

摘 要：以杂交兰品种台北小姐与小叶虎头兰杂交果荚、台北小姐自交果荚作为材料，比较了不同活性炭浓度对其种子萌发的影响，以及二者种子萌发形成的根状茎在同一种培养基中的增殖与分化情况。结果表明：添加活性炭1.0 g·L-1的培养基较适宜台北小姐自交组合种子无菌萌发，而台北小姐与小叶虎头兰杂交组合种子无菌萌发较适宜的培养基则为不添加活性炭;在1/2 MS+6

BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1培养基中，台北小姐自交组合根状茎的增殖效果较好，而台北小姐与小叶虎头兰杂交组合根状茎分化较好。

关键词：杂交兰; 无菌播种; 根状茎; 增殖; 分化

Abstract： By taking the hybrid fruit pod of Taibeixiaojie and Cymbidium hookerianum a kind of cymbidium hybrid， and the self-pollinated fruit pod of Taipeixiaojie as the materials， the effects of different concentrations of activated carbon on the seed germination were compared. And the proliferation and differentiation of rhizomes formed by their seed germination in the same culture medium were also compared. The results showed that the culture medium with 1.0 g·L-1 activated carbon was suitable for the sterile germination of the seeds of self-pollinated combination of Taibeixiaojie， while the culture medium with no activated carbon was suitable for the sterile germination of the seeds of hybrid combination of Taibeixiaojie and Cymbidium hookerianum. Moreover， the culture medium with 1/2 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+no activater carbon 1.0 g·L-1 had better effect on the rhizome proliferation of self-pollinated combination of Taibeixiaojie， while it had better effect on the rhizome differentiation of hybrid combination of Taibeixiaojie and Cymbidium hookerianum.

Key words： Cymbidium hybrid; Sterile sowing; Rhizome; Proliferation; Differentiation

雜交兰Cymbidium hybrid是由国兰与大花蕙兰杂交培育而成的兰花新品种，兼有国兰的清新花香和大花蕙兰的花大色艳、花期长等优点，具有较高的观赏和经济价值[1]。近年来，一些品质优良的杂交兰品种，如台北小姐、韩国桃花、黄金小神童等，在市场交易中都有着不俗的表现[2]。然而杂交兰的种子细小，杂种胚经常发育不良、几乎无胚乳，自然条件下种子萌发困难[2-3]。传统的分株繁殖速度较慢，难以满足市场需求，现阶段多采用组织培养技术对杂交兰进行快速繁殖[4-7]，但不同品种、不同发育阶段所需的培养基配方存在明显差异。因此，开展不同品种杂交兰无菌播种、根状茎增殖与分化的研究，可为杂交兰新品种选育奠定理论基础。为此，本研究以杂交兰台北小姐自交获得的成熟果荚，台北小姐与小叶虎头兰杂交获得的成熟果荚为材料，通过组织培养手段，对杂交兰进行种子无菌播种，促使种子萌发获得根状茎，并探讨根状茎增殖、分化培养条件，以期探究杂交兰诱导、增殖与分化效果的最适宜条件。

1 材料与方法

1.1 材料

以杂交兰台北小姐Cymbidium hybrid Mrs.Tai-bei自交获得的成熟果荚（授粉后198 d）、台北小姐与小叶虎头兰杂交获得的成熟果荚（授粉后196 d）为供试材料，从其蒴果中收集种子作为外植体进行种子无菌萌发（图1）。材料来源于福建省农业科学院作物研究所兰花种质资源圃，试验在福建省特色花卉工程技术研究中心花卉育种实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 将采收的未开裂果荚先用无菌水冲洗2次，在超净工作台中用手术刀削除柱头及表皮病虫斑，再用70%酒精浸泡45 s，随后放入0.1%升汞溶液中浸泡消毒10 min（浸泡过程中要不时摇晃容器，使消毒更充分），紧接着用无菌水冲洗4次，再用无菌纸吸干水分，在接种盘上切开果荚，将种子均匀撒播在培养基表面。

1.2.2 种子萌发培养 以1/2MS为基本培养基，通过添加不同浓度的活性炭，设置3个水平，分别为0、0.5和1.0 g·L-1，每个处理3次重复，并附加6BA 2.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1、白糖20 g·L-1、琼脂粉6.0 g·L-1，pH 5.8，对种子进行无菌萌发，接种120 d后观察种子的萌发情况。

1.2.3 根状茎增殖与分化培养 选择生长状态相近的种子萌发形成的根状茎，在无菌条件下分切成长0.6～0.8 cm的切段，接种于1/2 MS+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8.0 g·L-1+活性炭1.0 g·L-1的增殖和分化培养基，培养50 d后观测根状茎增殖与分化情况，计算增殖系数和芽分化率（%）。计算公式：增殖系数=新长出根状茎数量/接种根状茎数量，芽分化率=（分化出芽体的根状茎数/接种根状茎数）×100%。

1.2.4 数据处理 采用Excel 2007软件对数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 种子无菌萌发

台北小姐自交组合种子在诱导培养基上暗培养4个月后陆续有绿色芽点出现，芽点似球状突起。随着培养时间的延长，球状突起不断伸长，形成了根状茎（图2A）。从表1可以看出，采用不同培养基配方，萌发效果各异，随着活性炭浓度的增加，种子萌发效果越好，添加活性炭1.0 g·L-1的培养基较有利于种子萌发。

台北小姐与小叶虎头兰杂交组合种子在诱导培养基上暗培养4个月后同样有绿色芽点出现，并随着培养时间的延长发育成根状茎（图2B），同时出现部分分化成苗的现象（图2C）。从表2可以看出，培养基中活性炭添加浓度越高，种子萌发效果越弱，未添加活性炭的培养基对其种子萌发的效果较好。

2.2 根状茎增殖与分化培养

将无菌萌发阶段获得的根状茎作为增殖培养材料，利用1/2 MS+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8.0 g·L-1+活性炭1.0 g·L-1培养基，研究其对台北小姐自交组合、台交小姐与虎头兰杂交组合根状茎增殖与分化的影响。从表3可以看出，对于根状茎增殖效果来说，台北小姐自交组合根状茎增殖效果较好（图3A），增殖系数可达4.73;而对根状茎分化效果来说，台北小姐与小叶虎头兰杂交组合根状茎分化效果较好（图3B），芽分化率可达88.3%。

3 小结

兰科植物杂交种子通过无菌播种，在短期内获得其后代植株，是目前兰属杂交育种过程中应用较为广泛的一种快速繁殖方式。建立经济有效的离体培养体系是兰属杂交育種成功的关键途径之一。本试验筛选出台北小姐自交组合种子无菌萌发较适宜的培养基配方1/2MS+6BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1;台北小姐与小叶虎头兰杂交组合种子无菌萌发较适宜的培养基为1/2MS+6BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1，说明杂交兰台北小姐自交组合、台北小姐与虎头兰杂交组合种子萌发适宜的培养基配方不同。通过比较台北小姐自交组合、台北小姐与虎头兰杂交组合在同一培养基中根状茎增殖和分化效果，结果发现1/2MS+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8.0 g·L-1+活性炭1.0 g·L-1培养基更有利于台北小姐自交组合的增殖，更适合用于台北小姐与小叶虎头兰杂交组合根状茎分化。

参考文献：

[1]胡蕾，申婷.杂交兰的组织培养与快繁技术[J].浙江农业科学，2017，58（2）：259-260.

[2]蓝炎阳，钟淮钦，陈南川，等.大花蕙兰与墨兰种间杂交种子无菌播种繁殖技术研究[J].中国农学通报，2017，33（2）：61-66.

[3]陈瑶瑶，张燕，张琛，等.杂交兰‘韩国桃花’×蕙兰种间杂交种子无菌萌发特征研究[J].园艺学报，2009，36（3）：441-446.

[4]张先云，袁秀云，马杰.杂交兰的组织培养与快速繁殖技术研究[J].河南科学，2019，27（4）：419-421.

[5]左利娟，李志强，郑志勇，等.杂交兰根状茎的增殖与分化成苗技术[J].江苏农业科学，2015，43（6）：54-56.

[6]曾碧玉，常强，许传俊.杂交兰品种‘韩国小姐’与墨兰品种‘企剑黑墨’杂交坐果及无菌播种研究[J].热带作物学报，2015，36（3）： 510-515.

[7]郑君爽，宁惠娟，吕慧，等.国兰与大花蕙兰杂交育种及无菌播种研究进展[J].中国农学通报，2011，27（4）： 81-84.

（责任编辑：柯文辉）