不同地域来源乳粉及乳制品中乳铁蛋白含量分析

孙姗姗 罗娇依 李刚 梁瑞强 曹进 陈启 刘英华

摘 要：目的：考察不同地域来源的乳产品中乳铁蛋白的含量，为指导生产企业和消费者合理选择乳制品提供科学依据，也为国家市场监管部门制定乳制品中乳铁蛋白最低限量国家标准提供数据基础。方法：采用质谱绝对定量方法对103批次国内外乳原料及乳制品中乳铁蛋白含量进行分析，通过合成特异性标准多肽，进行内标法定量。结果：国内外乳原料、乳粉和液态乳中乳铁蛋白含量平均值分别为63.0、54.6、6.4mg/100g。中国国产乳原料、乳粉和液态乳中乳铁蛋白含量平均值分别为67.8、58.6、8.1mg/100g，均高于本次分析国内外样本量的平均值。另外，本研究还发现了不同地域来源的同类型乳产品中乳铁蛋白含量相差悬殊，同品牌的相似产品也存在较大差异。结论：不同地域来源乳粉及乳制品中乳铁蛋白含量差异较大，生产企业及消费者应合理选择乳制品摄入，未来，市场监管部门应尽快制定乳粉产品中乳铁蛋白最低限量的国家新标准。

关键词：乳铁蛋白;乳粉;乳粉原料;液态乳;含量分布

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种具有高生物活性的非血红素铁结合糖蛋白，它来源于牛乳、人乳、山羊乳和骆驼乳等原料乳中，在初乳中的含量丰富，常乳中可经过加工分离得到，高纯产品可作为高价值的营养补充剂[1]。由于LF多种多样的生物学功能，其可作为药物和营养品在临床上使用，具有良好的辅助治疗协同作用[2]。2010年之前，我国对LF的研究基本处于空白，随着国家卫健委于2013年11月发布第11号公告[3]扩大LF使用范围至婴幼儿配方食品，向乳粉、乳饮品中添加LF的产品迅速占领国内市场。虽然我国东北、西北和华北草原带以及胶东半岛属于国际公认的温带季风气候优质奶源带[4]，但由于LF提取技术的限制[5]，国内使用的LF多数依赖于进口。这不仅导致乳粉产品价格的波动，更使我国消费者对国产乳制品的质量产生质疑。为了更准确更深入地探究目前我国市场上流通的乳粉、乳制品以及原料粉中LF的含量真实情况，本研究针对以上几个研究对象分析LF含量及分布特征，即LF含量与其奶源产地的关联性。

目前，对于LF的分析测定方法较多，有分光光度法[6]、高效液相色谱法[7-9]、酶联免疫吸附法[10-12]、毛细管电泳法[13-15]、表面等离共振技术[16-17]等。但本研究的分析样本庞大，需要保证分析定量的准确性与实验操作的便捷性，故选择高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。前处理简单进行溶解后，使用少量溶解液进行酶解后即可采用质谱分析，质谱法测定大幅度降低了假阳性率的发生，并且内标法确保了定量的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters UPLC-Vevo TQ-S液相色谱串联三重四级杆质谱仪、Masslynx质谱软件，美国沃特世科技有限公司;G2涡旋振荡器，美国Scientific Industries公司;B-491恒温水浴锅，瑞士BUCHI公司;Seven Easy台式酸度计，瑞士梅特勒公司;贺力氏21离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司;ZWY-240恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司;ACQUITY UPLC HSS T3 C18亲水柱（2.1mm×100mm，1.8μm），美国WATERS公司。

乳铁蛋白特异肽段：序列为VDSALYLGSR，分子量1 080.22Da，纯度≥99%。乳铁蛋白同位素特异肽段：序列为VDSAL*YLGSR，L*（13C6，15N）同位素标记亮氨酸，分子量1 087.22Da，纯度≥95%。乳铁蛋白同位素内标肽段：序列为ALGFLRIPSKVDSAL*YLGSRYLTTLKNLRE，L*（13C6，15N）同位素标记亮氨酸，分子量3 403.02Da，纯度≥95%。以上所有合成肽段均由上海吉尔生化有限公司提供。甲酸、乙腈（质谱级），美国赛默飞世尔科技公司;氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司;三羟甲基氨基甲烷（分析纯），美国Sigma Aldrich公司;胰蛋白酶（质谱级），美国赛默飞世尔科技公司;实验用水均由纯水机（Milli-Q，Integral3）制备，电阻率为18.2MΩ·cm。本研究使用的乳粉样品采购于北京地区物美连锁超市、山姆会员店等正规商店;乳原料均采购于淘宝网络平台以及阿里巴巴采购网络平台。

1.2 乳铁蛋白的检测

1.2.1 样品处理 取1.000 0g乳粉样品，使用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲溶液溶解，充分振荡，60℃水浴1h，冷至室温并定容至50mL。取200μL溶解样品，加入200μL 0.1%Rapigest SF进行加热10min，80℃。冷却后加入50μL 2μmol/L乳铁蛋白同位素内标肽段（ALGFLRIPSKVDSAL*YLGSRYLTTLKNLRE）混匀，再向混合样品中添加10μg的胰蛋白酶，在37℃下温浴，过夜酶解（16～24h）。次日使用2μL10%甲酸溶液停止酶解反应，加水定容至1mL，15℃下10 000r/min离心10min，取上清液作为样品待测液。

1.2.2 分析检测条件 色谱条件：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3 C18亲水柱（2.1mm×100mm，1.8μm）;流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈;梯度洗脱：0～0.5min，5%B、0.5～4.5min，5%B～50%B、4.5～4.6min，50%B～75%B、4.6～6.6min，75%B、6.6～6.7min，75%B～5%B、6.7～9.0min，5%B;流速：0.3mL/min;柱温：30℃;进样量：5μL。

质谱条件：離子化模式：电喷雾正离子模式（ESI+）;扫描模式：多离子反应监测（MRM）;毛细管电压：3.5kV;锥孔电压：10V;离子源温度：150℃;偏转电压：50V;锥孔气流量：150L/h;脱溶剂气温度：500℃;脱溶剂气流量：800L/h;其他质谱参数见表1。乳铁蛋白特异肽段VDSALYLGSR配制成的定量标曲线性范围为1.25～100nmol/L，向各标准溶液中添加的同位素特异肽段VDSAL*YLGSR的浓度为100nmol/L。图1分别为乳铁蛋白特异肽段和同位素特异肽段的质谱提取离子流图，在3.40min两种肽段可以被彻底的分离和提取，该液相方法洗脱方法可以满足质谱定量的峰形要求。

2 结果与分析

2.1 乳粉原料国内外含量分析

大宗乳粉原料在食品加工行业内应用广泛，可用于制作奶味糖果、含乳饮料、咖啡伴侣、奶味零食、自制火锅底料等，由于被当作添加的食品辅料，其营养成分从未被关注过，但在终产品的包装上仍夸大含乳成分的营养价值。目前，在市面上普遍进口乳粉原料的产地集中在新西兰和波兰，从表2、图2可看出，乳业大国——新西兰（恒天然）的乳粉原料中LF含量从42.8～72.3mg/100g不等，差异明显，且有50%的检验批次含量都未达到总体分析的平均值63.0mg/100g。波兰的乳原料声称为乳清粉，但最终测定含量仅为44.0mg/100g。反之，观察中国产出的乳粉原料覆盖东北、山东、江苏、内蒙古几个产奶大省，除内蒙古外，其余原料乳粉中LF含量丰富，均优于国外同类产品，并高于本次分析总样本的平均值。

2.2 乳制品国内外含量分析

中国国内的乳粉和液体乳市场经本次调查后的检验结果较为理想，涉及到10个国产大中型企业品牌的产品，乳粉产品主要集中在婴幼儿配方乳粉和不同类型的营养乳粉，液体乳覆盖了全类型的乳饮品，儿童奶、早餐奶、复合营养奶、无乳糖奶、强化营养蛋白奶等。结果反映出了相关原料的2个问题，一是不同厂商的婴幼儿配方乳粉中LF含量差异较明显，品牌10和品牌1的一段婴幼儿乳粉相差了12倍之多，图3中也明显看出品牌10的LF含量远高于其余6个品牌。二是企业内部的不同类型乳粉产品的LF含量也差異悬殊，如表3中品牌1、7、9的产品都有此类情况出现。这可能是不同企业选购的乳粉基粉来源不同，也或许是不同类型产品针对的消费人群不同，采取了不同营养配方的调配比例。但纵观液体乳的检测值来看，不同品牌以及品牌内部的不同类型产品中LF含量比较均衡（表4、图4），波动范围是6.1～9.6mg/100g。我国的成品乳粉与液态乳中LF含量的比例是7～8倍，平均值分别是58.6、8.1mg/100g。

将中国国内市场的数据与国外产品数据进行横向比较后发现，对于调制乳粉而言，本次样本量的LF平均值为54.6mg/100g，中国产乳粉的营养质量位居国际水平的第三名且含量高于平均值。但与前两名瑞士和新西兰的乳粉产品的LF含量还是有一定的差距（图5）。爱尔兰、荷兰、丹麦乳粉产品的总体情况较低，低于平均值50%～77%。国外市场与我国国内市场出现的现象相似，同一国家的产品LF含量差异大，例如新西兰、爱尔兰、荷兰的产品（表5）。再观测液体乳产品情况，也与我国市场大致相同，产品间、产区间波动不大，LF含量平均值为6.4mg/100g（表6）。本次分析的产品产地中78%的国家都高于平均值，中国的液体乳产品营养质量较高，位居第二（图6）。新西兰、韩国的液体乳产品间LF的含量差异较明显，并且含量较低。

3 讨论

从本次分析结果来看，国际公认的优质奶源地与高LF含量的结果有所出入，不排除以下可能性：产品批次间存在差异，并非长期使用固定奶源;不同品牌的生产工艺对营养性蛋白有影响;劣质过期或经抽提乳粉经过重新包装，再次销售;不同地域奶源质量批次间差异较大等。目前，国家食品标准GB 14880—2012食品营养强化剂使用标准[18]中规定调制乳、风味发酵乳、含乳饮料中的LF的含量不得高于100mg/100g。以此标准来评判本次分析样本质量，国产乳粉、液体乳以及大宗乳粉原料均为合格产品。但从另一方面考虑，此标准并未定义LF的最低含量，由此引起的食品营养成分缺失、食品真实性问题、乳粉制造商的经济成本与宣传的产品营养价值不一致等问题日渐凸显。本次重点分析调制粉的产品类型为婴幼儿配方乳粉，也可观察出国内外产品均出现了LF含量高低分布不均的趋势。如国内婴幼儿配方乳粉中LF含量最低值为品牌1（7.7mg/100g），最高值为品牌10（95.0mg/100g）;国外最低值产于爱尔兰（12.7mg/100g），最高值产于瑞士（90.0mg/100g）。优劣产品间的LF含量有9～10倍的差距。

另一方面，规定及制定LF最低限量值，需结合参考人乳和牛乳中该成分的正常含量和儿童、成人的日常营养需求。据部分文献报道，分娩后3个月内母乳中LF含量大致在220～245mg/100mL，4个月后降至为102mg/100mL[19];牛初乳中的LF含量一般为150mg/100mL，牛常乳的含量则仅有10mg/100mL[20]。所以无论是人乳和牛乳的初乳中均含有高浓度的LF，而成熟乳中的乳糖和脂肪含量升高导致LF含量下降。因此，建议对婴幼儿配方乳粉的LF补充量按照不同哺乳时期进行限定，分阶段制定配方乳粉中的补充含量范围。从本次分析的情况来看，1段婴幼儿配方乳粉中LF含量的平均值只有国家标准要求上限值的一半，其中只有1批次进口荷兰乳粉品牌声称添加较高含量的LF，测定值为500.3mg/100g，与其标示值相符（数据未在列表中，避免使平均值偏离）。

4 结论

由于营养活性的不可替代性，LF在当今乃至未来的乳制品市场上会持续备受关注。从本次研究结论可以得出与普通消费者印象中不相符的结果，并非全部进口原料乳粉、调制乳粉以及液态乳的营养成分含量高于国产产品。因为我国也拥有极其优质的奶源带区域，生产、运输、加工成本远低于国外进口产品，其LF含量经分析位于全球前列，应成为我国消费者的首选。相关市场监管部门应进行调研后，制定出LF在不同类型产品中的最低限量，既能保障乳制品基本营养成分的缺失、造假问题，也可以维护市场同类产品价格悬殊的乱象。

参考文献

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（责任编辑 唐建敏）