不同炮制方法对林蛙油质量的影响

徐 阳，单柏宇，马玉莲，房 阔，鲍慧玮

(1.长春医学高等专科学校药学与食品学院，吉林长春130031；2.白城市食品药品检验所，吉林白城137000；3.长春中医药大学药学院，吉林长春130117)

林蛙油，又称哈蟆油，是中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)中雌性林蛙的输卵管干燥形成的脂肪状物，具有补肾益精，养阴润肺的功效[1]。随着全民健身意识的提升，目前林蛙油常常作为一种较名贵的“滋补佳品”流通，食用方法也由原来单一的传统冲泡法衍变出多种烹饪及处理方法[2-3]。

对于中药林蛙油来说，仅依靠几种化学成分含量很难全面评价其质量，总醇提物含量、脂溶性成分含量和酸值无疑是油脂类物质的评价依据，而作为主要活性成分之一的水溶性蛋白，也是衡量指标之一[4-7]。本文利用7种不同的炮制方法处理林蛙油，通过对其总醇提物、脂溶性成分、酸值和水溶性蛋白的测定，综合比较不同炮制方法对林蛙油质量的影响，为林蛙油的进一步市场开发提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

TU1810型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；RE-3000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；AB135-S型分析天平(澳大利亚梅特勒公司)；FA1004B电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)。

林蛙油(吉林省鼎源特产经贸有限公司，批号：20170801)，经由长春中医药大学中药鉴定教研室肖井雷副教授鉴定为正品，符合《中华人民共和国药典》(2015版一部)项下相关规定。

牛血清白蛋白对照品(北京索莱宝科技有限公司，批号：605U056)；硫酸铜、氢氧化钠、碘化钾、酒石酸钾钠、石油醚(沸程60～90℃)、无水乙醇、酚酞试液、乙醚，均为分析纯，购于北京化工厂。

1.2 不同林蛙油炮制方法

清炒：取林蛙油适量，粉碎，文火加热至褐色，取出，放凉。

酒炙：取林蛙油适量，粉碎，加十分之一的量的黄酒拌匀，闷透，用文火炒至焦褐色，取出，放凉。

炒炭：取林蛙油适量，粉碎，置热锅内，用武火炒至焦黑色，喷淋清水少许，取出，晾干。

煮制：取林蛙油适量，粉碎，加8倍水煮30 min，取出，干燥。

炖制：取林蛙油适量，粉碎，加入20%的量的水，炖至水完全被吸尽时，放凉，取出，干燥。

烘干(40℃)：取林蛙油适量，粉碎，置40℃烘箱中烘干4 h，取出，晾干。

烘干(100℃)：取林蛙油适量，粉碎，置100℃烘箱中烘干4 h，取出，晾干。

2 实验结果

2.1 不同炮制方法的林蛙油总醇提物的测定

称取不同林蛙油炮制品各10 g，加8倍无水乙醇，80℃水浴回流提取2次，每次30 min，过滤，收集滤液，旋转蒸发溶剂，转移至锥形瓶中并干燥至恒重。按照公式(1)，计算各供试品中总醇提物的含量，结果见表1。

(1)

其中，w1为总醇提物的含量，A1为干燥后供试品和容器的质量(g)，A2为容器的质量(g)，W为加入供试品的总质量(g)。

表1 不同炮制方法的林蛙油总醇提物含量测定结果

2.2 不同炮制方法的林蛙油脂溶性成分的测定

称取不同林蛙油炮制品各10 g，加8倍石油醚，75℃水浴回流提取2次，每次30 min，过滤，分别收集药渣和滤液，药渣备用，滤液旋转蒸发溶剂，转移至锥形瓶中并干燥至恒重[8]。按照公式(2)，计算各供试品中脂溶性成分的含量，结果见表2。

(2)

其中,w2为脂溶性成分的含量，A1为干燥后供试品和容器的质量(g),A2为容器的质量(g),W为加入供试品的总质量(g)。

表2 不同炮制方法的林蛙油脂溶性成分含量测定结果

2.3 不同炮制方法的林蛙油酸值的测定

取“2.2”提取并称定质量的石油醚提取物，加乙醇-乙醚(1∶1)混合液5 mL，临用前加酚酞指示液0.1 mL，用NaOH滴定液(0.1 mol/L)，调至微显粉红色，振摇使其完全溶解，用NaOH滴定液(0.1 mol/L)滴定至粉红色，持续30 s不褪色[9]。按照公式(3)，计算各供试品的酸值，结果见表3。

(3)

其中，x为供试品的酸值，A为消耗氢氧化钠滴定液的体积(mL)，W为加入供试品的总质量(g)。

2.4 双缩脲法测定林蛙油不同炮制品中水溶性蛋白含量

2.4.1 双缩脲试液的配制

取硫酸铜1.5 g、酒石酸钾钠6.0 g和碘化钾5.0 g，加水500 mL溶解，边搅拌边加入10%氢氧化钠溶液300 mL，用水稀释至1000 mL，混匀，即得。

2.4.2 对照品溶液的制备

精密称取牛血清白蛋白对照品适量，加水溶解并制成浓度为10 mg/mL的对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备

称取“2.2”保存的未炮制哈蟆油滤渣0.1 g，加pH为12的氢氧化钠溶液5 mL，混匀，涡旋混合3 min，静置30 min，加20 mL双缩脲试液，反复倒置10次混匀，静置30 min，再次摇匀，2000 r/min离心2 min，取上清液，即得。

2.4.4 线性关系考察

精密量取对照品溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置具塞试管中，各加水至1.0 mL，再分别加入双缩脲试液4.0 mL，立即混匀，室温放置30 min，依照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)紫外-可见分光光度法(通则0401)，在540 nm的波长处测定吸光度[10-11]；同时以0号管作为空白。以吸光度值为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。得到的线性回归方程为y=0.0258x-0.0019(R2=0.9985)，线性范围为0～10 mg/mL(图1)。

图1 蛋白质含量标准曲线

2.4.5 精密度试验

取同一供试品溶液6份，在540 nm波长下连续测定6次。结果水溶性蛋白吸光度的RSD为1.91%，说明该方法的精密度良好。

2.4.6 重复性试验

取供试品适量，精密称取6份，按“2.4.3”制备供试品溶液，在540 nm的波长处测定。结果水溶性蛋白的平均含量为39.28%、RSD为1.98%，表明该方法重复性良好。

2.4.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、10 h在540 nm的波长处测定，结果水溶性蛋白吸光度的RSD为1.53%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.4.8 回收率试验

称取已知含量的供试品粉末6份，每份约0.05 g，加入对照品溶液2 mL，再加入pH为12的氢氧化钠溶液3 mL，继续按“2.4.3”制备供试品溶液，在540 nm的波长处测定，结果见表4。

表4 加样回收率结果

2.4.9 样品测定

取“2.2”保存的各炮制品滤渣，每种样品称取5份，每份约0.1 g，按“2.4.3”制备供试品溶液，在540 nm的波长处测定，计算平均水溶性蛋白含量,结果见表5。

表5 不同炮制方法的林蛙油中水溶性蛋白含量测定结果

3 结论

林蛙油为油脂状物，总醇提物含量和脂溶性成分含量测定是指分别用不同的溶剂对药材中的可溶性物质进行测定，以其含量的高低评价药材的品质。本文对7种不同炮制方法处理的炮制品进行测定，烘干(40℃和100℃)、煮制、炖制与未炮制林蛙油的总醇提物含量接近，说明烘干(40℃和100℃)、煮制、炖制对总醇提取物的影响较小，酒炙、清炒和炒炭对总醇提物的影响较大，大量的化合物已经被转化成新的化合物，药效方面可能会有较大差异；脂溶性成分是重要的功能营养物质，对抗疲劳和增强免疫力等方面均有重要作用，随着炮制所用温度的升高，脂溶性化合物的含量也随之下降，温度可破坏脂肪酸类成分。其中被破坏程度：炖制>酒炙>煮制>炒炭>烘干(100℃)>清炒>烘干(40℃)>未炮制。

酸值表现林蛙油中游离脂肪类成分的含量，游离脂肪酸类化合物对于人体具有重要的生理活性，是林蛙油中不可缺少的营养成分之一，通过实验表明，煎制和炖制的方法使林蛙油中大量的脂肪酸类成分降低，而通过炒炭方法使其生成大量新的游离脂肪酸，使之含量有明显的升高。酒炙、烘干(40℃和100℃)能较好地保留脂肪酸类成分。

林蛙油主要成份是蛋白质[12-13]，本文参照2015年版《中华人民共和国药典》四部通则 0713脂肪与脂肪油测定法第三法——双缩脲法进行测定，测得水溶性蛋白含量：未炮制>烘干(40℃)>酒炙>烘干(100℃)>煮制>炖制>清炒>炒炭，不同炮制和加工方法均使水溶性蛋白成分有所降低，其中烘干40℃降低最少，和未炮制林蛙油几乎相当，可以较好地保护蛋白质类成分。其中高温炒炭降低最多，说明长时间和高温加热会破坏林蛙油中水溶性蛋白成分，故建议低温炮制和加工，保留林蛙油水溶性蛋白类成分。

综合来看，烘干(40℃和100℃)、酒炙、炖制、煮制、炒炭和清炒均对林蛙油中总醇提物、脂溶性成分、脂肪酸类化合物和蛋白质类化合物具有一定的影响，其中低温烘干的加工方式对林蛙油药效成分的保留有较好作用，而清炒和炒炭对各类成分破坏较大。温度和受热时间对林蛙油各类营养物质影响较大，食用和加工林蛙油时，建议控制加热温度和时间。