数字化单分子免疫分析技术研究进展及毒品领域应用展望

王继业 姚伟宣 王鹏娟 孟凡伟

摘  要：数字化单分子免疫分析（Simoa）技术是一种新型的超高灵敏度、特异性、全自动化的多重检测技术。该技术结合了单分子、图像识别、数字化分析和荧光检测技术，能实现单分子检测，目前已经在神经性疾病的微创检查、肿瘤早期诊断、炎症、感染性疾病甚至miRNA检测等领域进行大量研究，均取得了不错的成果。毒品成瘾、戒断和耐受实质上是机体的一系列生理、生化过程，Simoa技术用于吸毒人员的生理生化研究将有助于阐明毒品成瘾和耐受机制，并为毒品戒断药物的研制提供理论依据。

关键词：单分子免疫分析技术;毒品成瘾;生物标志物

中图分类号：O657.3;TP212.3      文献标识码：A 文章编号：2096-4706（2019）10-0016-03

Abstract：Digital single molecule immunoassay（Simoa）is a new type of ultra-sensitive，specific，fully automated multiplex detection technology. This technology combines single molecule，image recognition，digital analysis and fluorescence detection technology to achieve single molecule detection. It has been extensively used in the fields of minimally invasive neurological examination，early tumor diagnosis，inflammation，infectious diseases and even miRNA detection. The research has achieved good results. Drug addiction，withdrawal and tolerance are essentially a series of physiological and biochemical processes in the body. Simoa technology used in the physiological and biochemical research of drug addicts will help to clarify the mechanism of drug addiction and tolerance，and provide theoretical basis for the development of drug withdrawal drugs.

Keywords：single molecule immunoassay;drug addiction;biomarkers

0  引  言

毒品成瘾是指对毒品的心理依赖和生理依赖，是一种慢性、复发性的脑部疾病，严重影响个人健康、家庭和睦和社会安定。对毒品成瘾机制和戒断原理的研究将有助于吸毒人员进行科学、有效的毒品戒断。毒品进入人体后会进行一系列的生理和生化反应，产生大量的代谢产物，并改变人体各种生物分子的含量，这些生物分子的改变对与研究毒品成瘾机制和研制毒品戒断药物均有重要意义，是目前神经生物学的研究热点。

针对毒品生物标志物的研究，涉及到的检测方法包括色谱法、质谱法、光谱法和免疫法等，已经有大量文献进行了介绍。近几年出现了一种新型的超高灵敏度数字化单分子免疫分析（Simoa）技术。目前已经在神经、炎症、感染、肿瘤等方面获得了应用，取得了客观的成果，而在毒品检测方面还未见其应用。该技术超高灵敏度的生物标志物检测性能能检测到普通检测方法检测不出的物质，这对重新认识毒品成瘾带来的生理生化变化有及其重要作用，并将极大推进成瘾机制的研究进展。

本文综述了Simoa技术目前的应用领域及其优势，并对其在毒品成瘾机制和戒断药物研制方面的应用进行了展望。

1  技術原理

Simoa技术的基本原理为大量固定捕获抗体的磁珠与样本进行反应，通过控制磁珠和样本中抗原的比例，可以使每个磁珠只结合一个或不结合抗原，而后加入荧光标记的二抗，结合了抗原的磁珠将产生荧光信号;将磁珠-抗原抗体复合物加到刻满微孔的芯片上，通过控制微孔的尺寸，可以保证每个微孔只含有一个磁珠-抗原抗体复合物;而后在其表面铺一层特制的油进行荧光成像，根据图像上每个微孔是否发出荧光进行计数，通过荧光分子的比例可以推算出抗原的浓度，以数字化检测方式极大提高检测的灵敏度。该技术结合了荧光检测、单分子和数字化分析技术，具有超高灵敏度、特异性、全自动化、支持多重检测等性能。为了验证该技术的灵敏度，Rissin等对比了Simoa和酶联免疫分析技术在检测前列腺癌抗原方面的效果，结果Simoa的检测下限比酶联免疫反应低1000倍，达到了fg/mL[1]。

2  Simoa应用领域

基于Simoa的优良检测性能和操作方便性，目前已经有大量研究人员将其应用于神经性疾病、肿瘤、炎症、感染性疾病及miRNA检测等领域。

神经丝蛋白L（NFL）是一种能用于神经损伤检测的生物标志物。传统的免疫分析技术不能检出血清中的NFL，需要抽取病人的脑脊液，从而会产生较大损伤。Kuhle等用三种不同的免疫分析方法检测血液和脑脊液中的NFL，结果Simoa的检测下限为0.62pg/mL（0个样本低于检测下限）;电化学免疫分析技术的检测限为15.6pg/mL（20个样本低于检测下限）;酶联免疫分析技术的检测限为78.0pg/mL（18个样本低于检测下限），Simoa技术的检测下限是电化学免疫分析技术的25倍，是酶联免疫分析技术的125倍。而血清中NFL的水平与脑脊液中的水平相关，因而可以用Simoa技术进行脑部疾病和神经性疾病的微创检测[2]。Disanto等以Simoa技术对多发性硬化患者和健康人群的血清中的NFL浓度进行检测比较，结果有脑部和/或脊柱钆增强病变的患者血清NFL浓度高于健康人群，且浓度与病变数目相关，经过不同疗法治疗之后，病变患者的血清NFL浓度降低。而传统的分析技术不能检测这么低的血清NFL浓度，用Simoa技术检测血清NFL浓度可用于多发性硬化的早期诊断和治疗跟踪[3]。

用传统影像和生化技术进行肿瘤诊断，发现的时候多为中晚期，而早发现早治疗可以极大提高肿瘤患者的治愈率，近年来科学家们在尝试用不同的技术提高肿瘤标志物的检测灵敏度，从而达到早发现早治疗的目的。Simoa技术的超高灵敏度使其在肿瘤早期诊断和术后评估中有极大的应用前景。目前Simoa技术是唯一可以检测到前列腺切除术后血清中PSA浓度的方法，其检测灵敏度是传统免疫分析技术的1667倍，这对前列腺癌切除术后的复发风险评估和二次放疗具有重要意义，既可以避免过度放疗，也可以降低因介入不及时而导致的癌症复发[4]。

感染性疾病检测方面，Simoa技术也取得了优异的成果。Simoa技术的p24检测下限为4.87fg/mL，比传统免疫分析方法高2000～3000倍，能比传统免疫分析方法提前9～11天检测到HIV感染，这对HIV的治疗和传染预防具有很大意义[5]。Simoa技术还能将粪便中的艰难梭菌毒素的检测假阳性降低25%，是一种简单、经济的感染筛查方法。在登革热感染出现症状之前，目前的血清学实验无法检测到循环系统中IgG和IgM抗体，而Simoa技术能将IgG检测灵敏度提高1000倍，IgM检测灵敏度提高10000倍，可用来区分原发性和继发性感染，评估发生登革出血热（DHF）及登革休克综合征（DSS）的风险[6]。

炎症方面，Song等用Simoa技术监测克罗恩病TNF- α免疫治疗后细胞因子的变化。与对照相比，克罗恩病患者的血浆IL-6水平升高，但是TNF-α无显著不同，抗TNF-α治疗12周，患者的IL-6和TNF-α水平下降，而传统的分析方法灵敏度不够高，无法监测治疗后的TNF-α水平[7]。

Simoa技术不仅能进行免疫分析，通过设计还能检测核酸。在磁珠表面偶联捕获核酸探针，当核酸目标物存在时，将形成捕获核酸探针-目标物-信号核酸探针复合物;将复合物落到光盘的小孔中即可进行荧光数字化分析，得到核酸浓度。特别是用在miRNA检测方面时，Simoa技术的超高灵敏度和特异性性能，使得检测过程不需要进行靶向扩增。以三重血清回收率实验，用来检测检测人肺总RNA中的miR-141、miR-21和miR-16灵敏度和交叉反应，验证了Simoa技术在miRNA检测中具有超高灵敏度和特异性，其LOQ值接近10fM，且交叉反应少[8]。Rissin等用碱性肽核酸探针通过互补配对特异性结合miRNA-122，能识别单个碱基的错配，与健康人群对照相比，急性肝损伤患者血清中miRNA-122的水平较高[9]。

3  毒品成瘾研究

各类毒品进入人体后会到达脑部的不同区域，而后激活信号转导通路产生毒理作用，目前研究比较多的信号通路有阿片受體、多巴胺、大麻受体、谷氨酸受体和丝裂酶原活化蛋白激酶等，可以介导神经兴奋或抑制，从而影响行为、记忆和学习能力。早在90年代就有文献报道吗啡能刺激机体产生和释放细胞因子，其中最重要的是白细胞介素。而后在研究戒断药物AV411的时候发现，吗啡改变了胶质激活标志物、细胞因子、趋化因子和神经营养因子的表达[10]。Mao等进行进一步研究发现吗啡不仅具有很高的成瘾性和耐受潜力外，还可诱导免疫抑制。对脂多糖诱导的84种炎症相关基因表达情况监测后发现吗啡耐受动物脾脏中的TNF-α和IL-β显著降低。在毒品戒断药物研究方面，张晓辉及其合作研究者发现精神活性物质首先激活Toll样受体4（TLR4），从而活化小胶质细胞，产生炎症因子，正向调节信号通路，提高神经元兴奋性，以致毒品成瘾和依赖;他们通过设计和筛选发现可用于毒瘾戒断治疗的小分子抑制剂，并已经运用于临床试验[11]。毒品成瘾机制所涉及的生理生化过程繁多而复杂，目前已有很多的文献对毒品的成瘾机制进行了研究，涉及神经内分泌、细胞内信使等系统，检测的标志物包括免疫因子、炎症因子、RNA等。

4  结  论

Simoa技术是一种新型的免疫分析技术，检测原理涉及了单分子和数字化检测技术，具有超高灵敏度、特异性、能实现多重自动化检测，并且支持自主试剂研发。目前已经在神经性疾病微创检测和生理分析、肿瘤的早期诊断和术后风险评估、感染性疾病的早期检测和预防、炎症因子的研究等方面得到了应用。毒品成瘾和戒断过程中的生理生化过程复杂，到目前为止还没有完全阐明，将Simoa技术用于吸毒和戒毒人员的生物标志物研究将有助于发现含量微小的标志物，进而对成瘾机制研究和戒断药物的研制提供技术支持。

参考文献：

[1] Rissin D M，Kan C W，Campbell T G，et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfem-tomolar concentrations [J].Nature Biotechnology，2010，28（6）：595-599.

[2] Jens Kuhle，Christian Barro，Ulf Andreasson，et al. Comparison of three analytical platforms for quantification of the neurofilament light chain in blood samples：ELISA，electrochemiluminescence immunoassay and Simoa [J].Clinical Chemistry and Laboratory Medicine（CCLM），2016，54（10）：1655-1661.

[3] PHD D M G，MD B C，PHD B P，et al. Serum Neurofilament light：A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis [J].Annals of Neurology，2017，81（6）：857-870.

[4] Chang L，Song L，Fournier D R，et al. Simple diffusion-constrained immunoassay for p24 protein with the sensitivity of nucleic acid amplification for detecting acute HIV infection [J].Journal of Virological Methods，2013，188（1-2）：153-160.

[5] Gaylord S T，Abdul-Aziz S，Walt D R，et al. Single-Molecule Arrays for Ultrasensitive Detection of Host Immune Response to Dengue Virus Infection [J]. Journal of Clinical Microbiology，2015，53（5）：1722-1724.

[6] SONG L，HANLON DW，CHANG L，et al.Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease [J].Journal of immunological methods，2011，372（1-2）：177-86.

[7] Cohen L，Hartman M R，Amardey-Wellington A，et al. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays [J]. Nucleic Acids Research，2017，45（14）：137.

[8] Rissin D M，López-Longarela Barbara，Salvatore P，et al. Polymerase-free measurement of microRNA-122 with single base specificity using single molecule arrays：Detection of drug-induced liver injury [J]. PLOS ONE，2017，12（7）.

[9] Hutchinson M R，Lewis S S，Coats B D，et al. Reduction of opioid withdrawal and potentiation of acute opioid analgesia by systemic AV411（ibudilast）[J]. Brain，Behavior，and Immunity，2009，23（2）：240-250.

[10] Mao X，Sarkar S，Chang S L. Involvement of the NLRP3 inflammasome in the modulation of an LPS-induced inflammatory response during morphine tolerance [J]. Drug and Alcohol Dependence，2013，132（1-2）：38-46.

[11] 王曉辉.毒品的神经免疫药理学及创新药物发现 [J].中国药理学与毒理学杂志，2016，30（10）：1012.

作者简介：王继业（1982.03-），男，汉族，山东烟台人，副教授，博士，研究方向：毒品防控。