不同促透剂运用于隔药饼灸对高脂血症合并动脉粥样硬化兔主动脉形态及血清IL-6、IL-10的影响

廖宗力 孙璐 朱重政 黄文韬 谭静 阳仁达

[摘要]目的探讨氮酮和冰片作为促透剂运用于隔药饼灸对高脂血症合并动脉粥样硬化兔主动脉病理形态及血清炎症因子的影响。方法选取40只新西兰纯种兔随机分成5组，每组8只，即正常组、模型组、无促透剂组、氮酮组和冰片组。高脂血症合并动脉粥样硬化兔模型造模成功后除正常组和模型组外，其余各组采用隔药饼灸干预，每日1次，连续4周。采用ELISA检测血清白细胞介素6（Interleukin 6.IL-6）、白细胞介素10（Interleukin 10.IL-10）含量;采用HE染色，光学显微镜下观察主动脉组织形态。结果与正常组比，模型组IL-6水平显著升高、IL-10水平顯著降低（P<0.01）;与模型组比，无促透剂组、氮酮组及冰片组IL-6水平显著降低（P<0.01）、IL-10水平升高（p<0.05）;与无促透剂比，氮酮组和冰片组IL-6水平显著降低（P<0.01）、IL-10差异无统计学意义（P>0.05）;与氮酮组比，冰片组IL-6水平显著降低（P<0.01）、IL-10差异无统计学意义（P>0.05）。主动脉组织镜检结果示：正常组无异常;模型组可见组织整体凌乱，管腔壁可见明显增厚，内皮坏死，有明显的脂质斑块及泡沫细胞;无促透剂组有内膜增厚，可见少量泡沫细胞，细胞排列较模型组稍好，脂质沉积明显较模型组减少，斑块不明显;氮酮组和冰片组无显著异常。结论隔药饼灸对高脂血症合并动脉粥样硬化兔具有抑制炎症反应和抗动脉粥样硬化作用，在药饼中加入促透剂后施灸疗效更优，可能与药饼中药物透皮吸收增强有关，值得进一步临床应用和研究。

[关键词]隔药饼灸;促透剂;高脂血症;动脉粥样硬化;白细胞介素6;白细胞介素10

[中图分类号]R245.8[文献标志码]A [文章编号]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.017

高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是由于体内脂质转运和（或）代谢异常，导致机体血液脂质水平异常的病症。长期HLP导致脂质及泡沫细胞沉积在动脉内膜中，是诱发和促进动脉粥样硬化（atheroscle-rosis，AS）的重要危险因素。有研究表明，炎症反应贯穿AS病理变化全程，单纯降低低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterin，LDL-C）对AS疗效较差，同时进行炎症控制才能取得良好疗效。目前，HLP及AS病越来越高发，严重影响人们的健康与生活工作。临床对HLP及AS治疗方法较多且疗效确切，但药物内服所致毒副作用一直困扰HLP患者和医务工作者，因此，积极探索安全有效、便捷价廉、依从性高的降脂外治方案对促进患者健康、延长患者寿命、提高其生活质量有着重要的意义。李娟等研究表明，传统中医药疗法在降脂中疗效确切。隔药饼灸是一种特色中医外治疗法，课题组前期大量研究表明隔药饼灸降脂及治疗AS疗效肯定。因此，本研究探讨了在药饼中加入不同促透剂后施灸对HLP合并AS兔主动脉形态结构及血清炎症因子IL-6、IL-10的影响是否优于单纯隔药饼灸，以进一步探索增强隔药饼灸疗效的方案。

1材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用40只6-8月龄新西兰纯种兔（体质量2.0-2.5kg），由湖南中医药大学动物实验中心提供（清洁级，动物合格证号：SYXK<湘>2013-0005）。分笼饲养于动物实验室。温度保持20-25℃，湿度保持50%-70%。兔笼、笼架、食槽、水杯在使用前严格消毒处理并定时冲洗。按时按量喂养饲料，正式实验前适应性普通饲料喂养7d。按随机数字表法分成正常组、模型组、无促透剂组（高脂模型+使用水作溶剂做的药饼施灸）、氮酮组（高脂模型+使用氮酮溶液做的药饼施灸）、冰片组（高脂模型组+使用冰片溶液做的药饼施灸），每组8只。

1.2 主要试剂及仪器

氮酮（新乡高金药业有限公司，59227-89-3），精密量取脂溶性氮酮溶液5mL溶于100mL无水乙醇溶液中，混匀备用：冰片（山东百味堂饮片有限公司，207-352-6），精密称取冰片2g溶于50mL无水乙醇溶液中，再加入蒸馏水35mL稀释备用：10%乌拉坦（山东省齐鲁兴华制药有限公司，51-79-6）无水乙醇（SIGMA公司，E7023）;4%多聚甲醛（So-larbio）;神灸300灸艾炷（苏州东方艾绒厂，东方一型）;丙硫氧嘧啶（国药集团药业股份有限公司，XW00515251）;胆固醇（国药集团药业股份有限公司，69008214）;蛋黄粉（亳州海川蛋制品有限公司，57583-35-8）;猪油（市售）。药饼中药物组成：丹参、大黄、山楂、郁金、泽泻（购于湖南中医药大学第一附属医院中药房），将所有饮片打粉过200目筛等比例混合。药饼制作：将药粉按分组不同分别加入蒸馏水、氮酮溶液、冰片溶液调成糊状，比例为每100g药粉加入80mL溶液，用统一规格模具制作直径为1cm，高3mm的药饼。

酶标板（40孔或96孔）;台式冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司，GTRl6-2）：全自动酶标洗板机（济南来宝医疗器械有限公司，ST-36W）;酶标仪（南京德铁实验设备有限公司，HBS-1096A）;恒温振荡器（天津欧诺仪器股份有限公司，HNY-200B）;奥林巴斯显微镜（南京伊若达仪器设备有限公司，BX43）。兔IL-6ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-RB0014c）：兔IL-10ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-RB0487c）。

1.3模型制备

正常组采用普通饲料喂养，其余动物参考方法改良造模：每天于上午8：00喂养高脂饲料，每只兔约吃高脂饲料100g，其中蛋黄粉为15g、胆固醇为0.5g、猪油为5g、丙硫氧嘧啶为10mg/kg，其余为基础饲料。将以上成分按照比例混合（猪油加热溶解）拌匀，然后加工成颗粒状高脂饲料。喂养时，先喂完高脂饲料后再添加普通饲料，每只兔每天进食总量约为100-130g。饮水不限制，连续喂养12周后，随机抽样解剖见兔主动脉内壁有脂质斑块出现，参考戴氏标准检测动物血清TC、TG升高，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.05），表明造模成功。

1.4分组干预

正常组普通饲料常规喂养，模型组不予施灸，无促透剂组采用蒸馏水药饼、氮酮组采用氮酮溶液药饼、冰片组采用冰片溶液药饼行隔药饼灸，每日1次，连续4周。

1.5 穴位选择

参照李忠仁主编《实验针灸学》及拟人比照法制定取穴方法，采用如下两组穴位，每天施灸一组穴位，两组穴位交替施灸。A组取穴：双天枢、巨阙、双丰隆：B组取穴：双心俞、双脾俞、双肝俞。

1.6 隔药饼灸方法

将兔固定在兔台上，定位取穴后将穴位周围2cm兔毛剪除。用8%硫化钠溶液脱毛至兔皮裸露，用生理盐水冲洗干净，确保皮肤无破损。将艾炷放在药饼上，一起放于穴位上方皮肤处，点燃艾炷施灸。每组穴位隔天灸1次，两组穴位交替施灸，每穴4炷（约30min），连续4周。

1.7 检测指标及方法

1.7.1 血清指标检测 将兔固定、麻醉，剪去左侧胸部皮毛，络合碘消毒。从左前腋水平向上2-2.5cm（3-4肋间），可以触摸到心脏的跳动，此处为进针点。快速进针后针头向内胸骨方向与水平面呈45°角刺人，当针头深约3.5cm（9号针头）时抽血。抽取血液3mL注入到10%EDTA-Na 230uL及4x10⁵U/mL抑肽酶40uL试管中，手动摇匀，放人3000r/min、4℃恒温离心机离心10min。分离血清，ELISA检测IL-6、IL-10水平。

1.7.2 组织标本检测 将兔麻醉、固定，心脏采血后，空气栓塞处死。剖开胸腔，剪取从心脏发出段的主动脉弓3cm置于4%多聚甲醛固定液固定，以各级乙醇将标本脱水后用二甲苯透明处理，经石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红染色，光镜下（x200倍）观察主动脉病理形态变化。

1.8统计学处理

将实验结果所得所有数据进行统计，用SPSS18.0windows软件操作处理。各检测指标都用“x±s”来表示，各组之间进行两两对比，如果方差齐时用LSD法，方差不齐时则用Dunnet′s T3法分析。不满足正态分布时则用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组兔主动脉形态学比较

正常组显示无显著异常：模型组中整体模糊凌乱，各层分布不均，管腔壁内膜可见明显增厚，内膜不光滑不完整，内皮坏死，有明显的泡沫细胞浸润及脂质斑块沉积，表明造模成功：无促透剂组示内膜仍有增厚，平滑肌细胞排列无序但较模型组稍好，可见少量泡沫细胞，脂质沉积较模型组明显减少，斑块不明显：氮酮组中整体结构较整齐，内膜无明显增厚，平滑肌细胞排列较无促透剂组整齐，可见极少量的泡沫细胞：冰片组整体较无促透剂组、氮酮组更加清晰整齐，无显著异常。见图1。

2.2 各组兔血清IL-6、IL-10含量比较

与正常组比，模型组IL-6水平显著升高（P<0.01）、IL-10水平显著降低（P<0.01）;与模型组比，无促透剂组、氮酮组及冰片组IL-6水平显著降低（P<0.01）、IL-10水平升高（P<0.05）;与无促透剂组比，氮酮组和冰片组IL-6水平显著降低（P<0.01）、IL-10差异无统计学意义（P>0.05）;与氮酮组比，冰片组IL-6水平显著降低（P<0.01）、IL-10差异无统计学意义（P>0.05），如表1所示。

3讨论

HLP是西医学病名，传统中医无对应病名，但中医学中有“膏”“脂”的论述。《灵枢》曰：“五谷之津液合而为膏者……。”张景岳《类经》有云：“膏，脂膏也。”西医认为，血脂升高，会导致血液粘稠度升高、血液流速减慢，长期高血脂可引起血管内皮损伤，从而导致脂质、血小板等沉积在血管损伤局部，发生慢性炎症改变，形成粥样硬化斑块。早期症状与中医痰浊极为相似，后期血管损伤、粥样斑块形成与中医的“瘀血”相近，因此，中医认为本病病机主要为痰浊瘀血阻滞。有研究指出：灸法“以温促通”，能疏通经络，促进气血运行，治疗HLP疗效较佳。

隔药饼灸是一种特色灸法，结合艾燃烧的温热刺激、药饼中药物的作用及经络穴位三位一体共同发挥效用，是针灸疗法的重要组成。有研究指出，隔药饼灸具有明确抗炎作用。IL-6由多种细胞（如单核/巨噬细胞等）分泌，研究表明IL_6是促进AS形成的一种多功能细胞因子，且它在AS病理演变过程中大量存在，其导致AS炎症机制可能与激活巨噬细胞，加强巨噬细胞对低密度脂蛋白的摄人，刺激基质降解酶的合成，上调黏附分子的表达有关。本研究结果表明，HLP合并AS模型兔血清IL-6显著高于正常组，采用隔药饼灸治疗后各组血清IL-6水平均显著低于模型组，提示隔药饼灸可抑制IL-6表达，这可能是隔药饼灸抗炎抗AS的机制之一。且氮酮组和冰片组IL-6水平下降幅度最大，说明采用两种促透剂分别运用于藥饼后施灸对抑制IL-6表达具有增效作用。IL-10主要由CD4+淋巴细胞和巨细胞产生，具有强大抗炎作用。Potteaux等研究表明，AS小鼠IL-10升高能显著减少AS损伤区域面积。Galigiuri等发现敲除大鼠apoE基因，IL-10减少，AS斑块面积显著增加，表明升高IL-10具有抗AS作用。本研究结果显示，无促透剂组、氮酮组、冰片组IL-IO水平明显高于模型组，这说明隔药饼灸通过升高IL-10水平抗炎的作用极其优越。但本次实验发现，与无促透剂相比，氮酮组和冰片组IL-10水平虽然有升高趋势，但是差异无统计学意义（P>0.05），表明本次实验中，在药饼中加入促透剂氮酮或冰片后施灸，对HLP合并AS兔血清IL-IO的上调表达无显著增效作用，也可能存在影响IL-10表达的其他因素，有待进一步研究探索。

隔药饼灸作用的发挥离不开药饼中的中药作用。本次实验药饼中大黄、山楂、泽泻、郁金、丹参五味中药在实验及临床研究中多次证实其有效成分具有明确的降脂作用。有研究表明氮酮和冰片对多种亲水或亲脂性药物成分具有促进其透皮吸收的效果。本研究结果显示，在药饼中加入促透剂氮酮或冰片对血清IL-6水平及主动脉组织病理形态的调节作用更显著，表明隔药饼灸作用的发挥可能与药饼中有效成分的透皮吸收相关，且冰片组IL-6水平显著低于氮酮组，说明冰片略优于氮酮。

综上，隔药饼灸可抑制HLP合并AS兔炎症反应，这可能是隔药饼灸抗AS的作用机制之一。同时，隔药饼灸能促进AS兔主动脉组织损伤修复，在药饼中加入促透剂后施灸疗效更佳，可能与药饼中药物透皮吸收增强有关，值得进一步临床应用和研究。