健脾益肠散对溃疡性结肠炎大鼠CD86和ICAM-1表达的影响

蔺晓源 徐菲 张嘉伦 赵应松 王敏 刘杰民 胡国恒

[摘要]目的观察健脾益肠散对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）大鼠CD86分子（CD86）和细胞间黏附分子-1（intercellu-lar adhesion nolecule-1.ICAM-1）表达的影响，探讨其对UC肠黏膜的免疫保护机制。方法将60只SD大鼠先随机分力空白组和造模组，造模组采用2，4.6-三硝基苯磺酸（2，4.6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）溶液灌肠法制备UC大鼠模型，待模型复制成功后再将造模组随机分为模型组、西药组和中药高、中、低剂量组;干预21d后，免疫组化法检测各组大鼠结肠组织中CD86的阳性表达，Westem Blot、RT-PCR法分别检测结肠中ICAM-1的蛋白和mRNA表达。结果与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中CD86的阳性表达以及ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著增高（P<0.01）;与模型组比较，中药高、中、低剂量组和西药组CD86、ICAM-1的表达均不同程度地降低（P<0.05或P<0.01），且以中药高剂量组最为明显（P<0.05或P<0.01）。结论健脾益肠散可能通过降低结肠组织中CD86、ICAM-1的表達水平起到对UC结肠黏膜的免疫保护作用。

[关键词]溃疡性结肠炎;健脾益肠散;CD86分子;细胞间黏附分子-1

[中图分类号]R285.5;R656.9[文献标志码]A [文章编号]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.006

溃疡性结肠炎（ulcerative colkis，UC）是一种反复发作的以腹痛、腹泻和便血等症状和体征为主要临床表现的特发性慢性炎症性肠病。UC病因尚不清楚，研究认为其发病与遗传、环境、感染、微生物群失调和免疫应答等因素密切相关。目前UC的西医治疗药物常包括柳氮磺胺嘧啶等氨基水杨酸制剂，布地奈德等糖皮质激素、硫唑嘌呤等免疫抑制剂，英夫利昔等生物制剂及微生态制剂，临床多联合用药，虽有成效，但仍面临不良反应大、易复发等诸多问题。健脾益肠散是基于UC“本虚标实”的中医病机组方的董菲洛教授经验方，临床治疗UC安全有效，并能明显改善患者机体的免疫功能。为了进一步明确健脾益肠散治疗UC的作用靶点，鉴于CD86分子（CD86）和细胞间黏附分子1（Intercellular adhesionmolecule-1.ICAM-1）异常已被证实在UC发病的免疫机制中起重要作用。因此，本研究观察健脾益肠散对UC模型大鼠结肠组织CD86、ICAM-1表达的影响，以深入探讨其对UC结肠黏膜的免疫保护机制。

1材料与方法

1.1实验动物

SD大鼠60只，SPF级，雄性，体质量180-220g，由重庆腾鑫华阜实验动物销售有限公司提供，许可证号：SCXK-（军）2012-0011。饲养于SPF级实验动物房，饲养温度21-25℃湿度50%-70%，符合饲养环境标准要求。所有大鼠自由饮水、进食，每2天更换一次垫料。

1.2实验药物

健脾益肠散全方由太子参15g，黄芪15g，白术12g，木香6g，白豆蔻6g，茯苓12g，芡实12g，败酱草30g，补骨脂20g，炙甘草6g组成。中药饮片均购自贵州省中医院门诊中药房，浓缩成生药含量分别为15、10、5g/mL的药液冰箱冷藏备用。西药柳氮磺吡啶肠溶片（上海福达制药有限公司，规格：0.25g/片），配制成浓度为22.1mg/mL的药液冷藏备用。

1.3主要试剂与仪器

CD86JCAM-1兔抗多克隆抗体（abcam），PCR引物合成（南京金斯瑞生物科技有限公司），引物序列：ICAM-1-F：CGGGATGGTGAAG7CTGT，ICAM-1-R：GGCGGTAATAGGTGTAAATG，产物片段长度200bp;GAPDH-F：CAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH-R：CCAGTAGACTCCACGACAT，产物片段长度138bP。BCA蛋白浓度测定试剂盒（Bio-Swamp），蛋白质Mark-cr（Thermo），逆转录试剂盒（TAKARA），PCR试剂盒（KAPA Biosystems），2.4.6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma）。Z32HK高速冷冻离心机（德国Hermle），RM2235石蜡切片机（德国莱卡），MK3酶标仪（芬兰雷勃），BX51显微镜和图像分析系统（日本奥林巴斯），Mini Protean tetra cell蛋白印记系统、T100梯度PCR扩增仪、CheemiDoc XRS+Imager化学发光系统（美国BIO-RAD），Realplex 2荧光定量PCR仪（德国Eppendorf）。

1.4动物分组与模型复制

将60只大鼠先按体质量用随机数字法分为2组，正常组（10只）和造模组（50只）。造模组参考文献方法[6]将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，然后肛内8cm处注入TNBS溶液制备UC大鼠模型。待模型复制成功后再将造模组随机分为5组，分别为空白组、模型组、西药组和健脾益肠散3个剂量组（简称中药高、中、低剂量组），每组10只。

1.5干预与标本取材

从造模第3天起，西药组给予0.3g/kg的柳氮磺吡啶肠溶片药液，中药高、中、低剂量组分别给予204、136、68g/kg的健脾益肠散药液，模型组给予蒸馏水。灌胃体积量均为13.6mL/kg，连续灌胃21d。

空白组大鼠和各给药组大鼠在最后一次灌胃后禁食不禁水24h，然后予以水合氯醛麻醉。冰盒上剪取距离肛门10cm处的末端结肠，其中一小段用生理盐水漂洗后装入冻存管中放置在-80℃冰箱中保存供Western Blot和RT-PCR检测使用，另一小段放人多聚甲醛中供免疫组化检测使用。

1.6指标检测

1.6.1CD86阳性表达的免疫组化法检测 每组随机取出结肠组织标本5个，流水冲洗，不同浓度的乙醇逐级脱水，置人纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中透明，石蜡包埋切片，一抗（CD86抗体，稀释比例1：100）孵育，maxvision二抗孵育，DAB显色，苏木素复染3min，透明、封片。使用400倍镜选取阳性表达（以胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒染色为标志）不重复的5个视野拍片，最后使用图像分析系统分析CD86阳性染色的平均OD值。

1.6.2ICAM-1蛋白表达的Western Blot法检测 每组随机取出结肠组织标本5个，按每20mg组织加入150-250uL裂解液提取蛋白，使用酶标法进行蛋白定量，制备SDS-PAGE胶（下层分离胶选用12%的胶），每孔上样10ug蛋白，经电泳、湿转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入一抗（ICAM-1抗体，稀释比例1：1000）室温孵育1h、1：10000稀释HRP标记的二抗室温孵育1h，显色后将膜置于化学发光系统中检测。

1.6.3ICAM-1mRNA表达的RT-PCR法检测 每组随机取出结肠组织标本3个，根据Real-TimePCR的操作方法进行组织总RNA的提取、cDNA第一条链的合成（总RNA中DNA的消除：总RNA中DNase 1的消除;反转录：42℃，60min;70℃，15min;16℃，hold）和PCR扩增。数据采用仪器自带软件qbase plus分析每个样本待测基因相对于内参基因GAPDH的相对表达量。

1.7统计学处理

实验数据均采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。计量资料以“x±t”表示，多组间的比较满足正态性检验后，方差齐时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用Tamhane′s T2法。不满足正态性分布的采用非参数检验。P<0.05代表差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠结肠组织CD86的阳性表达

与空白组比较，模型组CD86的阳性表达显著增多（P<0.01）：各给药组均可不同程度地降低CD86的阳性表达（P<0.05或P<0.01）：且中药高剂量组优于其他给药组（P<0.05或P<0.01），中药低剂量组不及中药中剂量组和西药组（P<0.05），而中药中剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图1。

2.2各组大鼠结肠组织ICAM-1的蛋白表达

与空白组比较，模型组ICAM-1蛋白表达明显增多（P<0.01）;各给药组与模型组比较，ICAM-1的蛋白表达均不同程度地减少（P<0.05或P<0.01），且以中药高剂量组最为明显（P<0.01），而中药中、低剂量组与西药组比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。见表1、图2。

2.3各组大鼠结肠组织ICAM-1mRNA表达

模型组ICAM-1mRNA表达较空白组显著升高（P<0.01）：各给药组ICAM-1的mRNA表达与模型组比较均不同程度地降低（P<0.05或P<0.01），且中药高剂量组优于中药低剂量组和西药组（P<0.05），而中药中、低剂量组与西药组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3讨论

树突状细胞（dendritic cells，DC）是功能最强大的抗原提呈细胞，也是激发免疫应答的始动细胞。DC参与UC肠道黏膜免疫激活和免疫耐受，结肠黏膜DC浸润的频率与UC活动性炎症的严重性显著关联。成熟DC高表达共刺激分子CD86和黏附分子ICAM-1等，可有效激活T细胞免疫应答。而当特定的CD86、ICAM-1等缺乏时，T细胞活化受到抑制，进而导致外周免疫耐受产生。Scarpa M等研究表明，CD86的表达在UC患者中明显存在，而健康受试者体内未检测到CD86.且CD86的表达与疾病的持续时间呈负相关，其研究证实了CD86在UC发病中的主要作用。而早在Nakazawa A等探讨共刺激分子CD86在人结肠上皮细胞中的表达及其在炎症结肠黏膜T细胞活化中的作用时就发现，抗原提呈细胞可通过CD86在炎症结肠黏膜中的表达促进T细胞的活化。TNBS诱导的UC模型大鼠结肠黏膜ICAM-1的阳性表达较正常大鼠明显增强。柳氮磺吡啶可降低老年UC患者肠黏膜ICAM-1的mRNA表达，检测ICAM-1水平可作为判断UC疗效的指标。我们前期的研究也表明UC模型大鼠血清ICAM-1含量较正常大鼠显著升高，免疫组化结果则证实其在结肠中的阳性表达亦高于正常大鼠。因此，CD86和ICAM-1在UC发病的免疫应答机制中起重要作用。

UC属中医学“泄泻”“肠癖”等范畴，其本在于脾气亏虚，其标在于气滞、湿热和血瘀。若饮食失摄，脾胃运化失司，则脾气虚弱，肠胃不固。气虚无以御邪，邪留肠间，日久不化，终致气滞、湿热、血瘀复合而伤，溃肠化疡，日久则更易伤及先天肾元致使疾病缠绵不愈。王爱华教授也认为，UC的根本病机为本虚标实，脾虚失运为其本，湿热、热毒为其标，日久夹瘀，脾肾双亏。因此，针对此本虚标实之证治宜扶正祛邪、标本兼治。健脾益肠散方中黄芪补气固表、敛疮生肌、固肠御邪为君;太子参益气健脾，《中药志》言其：“治脾虚泄泻”;白术健脾益气、燥湿利水，《药性论》言其：“主多年气痢，止下泄”;白豆蔻化湿行气;木香行气止痛、抗菌止泻，《日华子本草》言其：“止泻，治痢疾”：败酱草清热行瘀消痈，共为臣药。补骨脂补肾止泻，《本草纲目》言其：“治肾泄，通命门”;芡实益肾补脾止泻;茯苓健脾渗湿，共为佐药。甘草补脾益气，缓急止痛，调和诸药为使。现代药理研究表明，黄芪中的黄芪多糖对非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均具有明显的促进作用。太子参多糖粗提物能升高CD3、CD4、CD4/CD8.具有增強辅助性T细胞的作用，可增强免疫功能。此外，白术的免疫调节作用，茯苓、补骨脂的增强免疫、抗炎作用也得到证实。而甘草黄酮类成分是甘草用于腹部解痉、“缓急止痛”功效的主要活性成件。

课题组在前期的实验研究中发现，健脾益肠散可能通过促进热休克蛋白70的表达、降低CD40分子的表达而起到对UC大鼠结肠黏膜的免疫保护作用。本研究采用经典的TNBS/乙醇法复制UC大鼠模型，结果显示，模型大鼠结肠CD86的阳性表达以及ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著高于正常大鼠，说明UC肠黏膜的免疫应答被有效激活。健脾益肠散高、中、低剂量均可不同程度地降低CD86和ICAM-1的表达，且以健脾益肠散高剂量效果最为显著，也明显优于西药组。同时表明健脾益肠散治疗UC的作用机制可能与下调CD86的阳性表达，降低ICAM-1的蛋白和mRNA表达，进而通过调节机体免疫应答向免疫耐受方向发展而减轻免疫损伤有关。