舒血宁联合磷酸肌酸钠治疗对心肌梗死大鼠的心肌保护作用及对血管再生的影响

吴利杰 于收 冯韩章

摘要 目的：探究舒血寧联合磷酸肌酸钠对心肌梗死大鼠的心肌保护作用及对血管再生的影响。方法：将60只建模成功的心肌梗死大鼠随机分为模型组、磷酸肌酸钠及联合组，每组20只，另选20只SD大鼠仅于左冠状动脉前降支穿线而不结扎作为假手术组。磷酸肌酸钠及联合组分别腹腔注射磷酸肌酸钠[0.2 g/（kg·d）]、磷酸肌酸钠[0.2 g/（kg·d）]+舒血宁[10 mL/（kg·d）]，模型组及假手术组则注射等体积生理盐水，各组均连续干预4周。检测并比较各组大鼠心功能指标;观察各组大鼠心肌组织病理学形态变化;比较各组大鼠心肌组织微血管密度及血管内皮生长因子（VEGF）表达情况。结果：模型组大鼠左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）较假手术组升高，而磷酸肌酸钠组及联合组较模型组降低，且联合组显著低于磷酸肌酸钠组，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组大鼠左心室短轴收缩率（FS）及左心室射血分数（LVEF），心肌组织CD31、VEGF蛋白A值及MVD较假手术组降低，而磷酸肌酸钠组及联合组较模型组升高，且联合组显著高于磷酸肌酸钠组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：舒血宁联合磷酸肌酸钠有效促进心肌组织缺血区域血管新生，改善心肌梗死大鼠心肌病理损伤，恢复其心功能，疗效显著优于单用磷酸肌酸钠。

关键词 心肌梗死;舒血宁;磷酸肌酸钠;心肌保护;心功能;血管再生;表达

Myocardial Protection of Shuxuening Combined with Sodium Phosphate in the Treatment of Myocardial Infarction in Rats and the Effect on Angiogenesis

Wu Lijie1， Yu Shou2， Feng Hanzhang1

（1 Xianyang Hospital of Yan′an University， Xianyang 712000， China; 2 Rizhao Hospital of Traditional Chinese Medicine， Rizhao 276800， China）

Abstract Objective：To explore the myocardial protection of Shuxuening combined with sodium phosphate in the treatment of myocardial infarction in rats and the effect on angiogenesis.Methods：A total of 60 cases successfully modeling myocardial infarction rats were divided randomly into a model group， a sodium phosphate group and a combined group， with 20 cases in each group， and another 20 SD rats were only in the left anterior descending coronary artery threading without ligation and acted as sham-operation group.The sodium phosphate group and the combined group treated with intraperitoneal injection of sodium phosphate 0.2 g/（kg·d）， sodium phosphate 0.2 g/（kg·d）+ Shuxuening 10 mL/（kg·d）respectively.The model group and the sham-operation group were treated with intraperitoneal injection isovolumetric saline.Each group was treated for 4 weeks continuously.The rat cardiac function indexes in each group were detected and compared.The myocardial tissue pathology morphological changes were observed in each group.The myocardial tissue microvascular density and VEGF protein expression in each group were detected and compared.Results：The LVEDd， LVESd of rats in the model group were higher than those in the sham-operation group， while the sodium phosphate group and the combined group were lower than the model group， and the combined group was lower than the sodium phosphate group（P<0.05）; the FS， LVEF， IOD values of myocardial tissue CD31， VEGF protein and MVD in the model group were lower than those in the sham-operation group， while the sodium phosphate group and the combined group were higher than the model group， and the combined group was higher than the sodium phosphate group（P<0.05）.Conclusion：Shuxuening combined with sodium phosphate can promote the myocardial tissue ischemia region of angiogenesis effectively， improve the myocardial pathological damage of myocardial infarction rats， and restore the heart function.The effect is better than sodium phosphate alone significantly.

Key Words Myocardial infarction; Shuxuening; Sodium phosphate; Myocardial protection; Cardiac function; Angiogenesis; Expression

中图分类号：R283文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.015

心肌梗死是目前死亡率较高的心血管疾病之一，其主典型症状是心肌组织缺血性坏死，是在冠状动脉病变的基础上所发生的冠状动脉血供受阻或中断，心肌组织持续严重缺血继而导致心肌组织大面积梗死，严重者甚至造成心力衰竭，危及生命健康[1]。磷酸肌酸钠是一种典型的心肌能量代谢药物，具有显著的心肌保护作用，且杨顺茂[2]研究报道，其可有效减轻心肌梗死患者缺血再灌注损伤，降低不良心脏事件的发生。舒血宁是中药银杏叶的有效提取成分，李娜等[3]研究报道，其可促进血管扩张、扩张冠状动脉，改善冠脉微循环，保护心肌组织，并已逐步用于心血管疾病的临床治疗，但目前有关其联合西药对心肌梗死的临床研究报道尚不多见，且有关其心肌保护作用机制尚不明确。本研究旨在探究舒血宁联合磷酸肌酸钠治疗心肌梗死大鼠，其对心功能、心肌组织病理学损伤及心肌组织血管再生的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取雄性、清洁级、健康SD大鼠80只，6周龄，体质量250～300 g，购于第四军医大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（军）2007-007号。饲养条件：延安大学实验动物中心清洁环境动物实验室，每笼5只，温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，光照明暗时间比为12 h/12 h，自由获取食物和水。本实验操作遵循实验动物伦理学要求，伦理审批号：20191823。

1.1.2 药物 舒血宁注射液（通化谷红制药有限公司，国药准字Z22026295，批号：130103）;注射用磷酸肌酸钠（北京朋来制药有限公司，国药准字H20056412，批号：20111221）。

1.1.3 試剂与仪器

主要试剂：SP免疫组织化学试剂盒（南京建成生物有限公司，批号：20120901）;兔抗鼠CD31、血管内皮生长因子（VEGF）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：20121102）等。

主要仪器：石蜡切片机（沈阳益得电子有限公司，型号：CUT4062），组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：YD-A），多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cybernetics公司，型号：Image Pro Plus 6.0）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将雄性健康SD大鼠以乙醚麻醉，于左侧第4肋间处剪开皮肤，分离肌肉，暴露胸腔，结扎左冠状动脉前降支，随后，逐层缝合，所有操作均在无菌环境下进行，构建心肌梗死大鼠模型[4]。术后24 h经心电图检测确诊存在心肌梗死，排除由于手术操作或者建模后其他不适等因素所致的死亡大鼠及未建模成功大鼠;另随机选取20只大鼠作假手术处理，仅于左冠状动脉前降支穿线而不结扎，作为假手术组。将建模成功的60只急性心肌梗死（AMI）大鼠随机分为模型组、磷酸肌酸钠组及联合组，每组20只。

1.2.2 给药方法

磷酸肌酸钠组腹腔注射磷酸肌酸钠0.2 g/（kg·d），联合组腹腔注射磷酸肌酸钠0.2 g/（kg·d），舒血宁注射液，10 mL/（kg·d）;模型组及假手术组则灌胃等体积生理盐水，各组均连续干预4周。

1.2.3 检测指标与方法

心功能指标检测：末次干预结束后，将各组大鼠均以戊巴比妥钠注射麻醉，经胸超声心动图检测，以为胸骨旁短轴切面测量并记录大鼠左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd），计算左心室短轴收缩率（FS）及左心室射血分数（LVEF）。据同一平面短轴切面获取，各切面记录2个图像[5]。

观察大鼠心肌组织病理学形态：心功能检测结束后，断头法处死所有大鼠，开胸，采取心脏，生理盐水冲洗血液，采集基底部梗死边缘区心肌组织，置于福尔马林溶液中固定24 h，常规制作石蜡切片，厚度4 μm。进行苏木精-伊红（HE）染色[6]观察大鼠心肌组织病理学形态。

免疫组织化学染色观察大鼠心肌组织微血管密度及VEGF蛋白表达情况：心肌组织石蜡组织切片制作同上，经二甲苯脱蜡，水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，石蜡切片复温，滴加一抗（CD31、VEGF抗体，工作浓度1∶100），4 ℃下孵育过夜;滴加二抗：广谱通用型非生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min;光学显微镜滴下DAB显色，中性树胶封片，于光学显微镜下判定染色结果，阳性着色为心肌细胞细胞核或细胞质棕黄色。高倍镜下统计心肌梗死边缘区CD31阳性细胞表达情况，计算单位面积内CD31阳性微血管数量，随机选取5个视野求平均值即为微血管密度（MVD）;CD31阳性微血管计数标准：单个内皮细胞、内皮细胞簇、微小血管均予计数，带有较厚肌层区域的血管均不计数;另以Image-Pro Plus多功能真彩色细胞图像分析管理系统统计心肌组织CD31、VEGF蛋白阳性表达吸光度值（A），A越大则阳性表达率越高[7]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布，采用配对样本t检验;不符合正态分布，则采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较

模型组大鼠LVEDd、LVESd较假手术组升高，而磷酸肌酸钠组及联合组较模型组降低，且联合组显著低于磷酸肌酸钠组，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组大鼠FS、LVEF较假手术组降低，而磷酸肌酸钠组及联合组较模型组升高，且联合组显著高于磷酸肌酸钠组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组心肌组织病理学形态观察

HE染色显示，假手术组心肌组织排列整齐;模型组心肌组织染色不均，且排列紊乱，伴有大量炎性细胞浸润，且细胞间隙增大，偶见少量肌溶灶，梗死区心肌透壁性坏死，苍白色;磷酸肌酸组及联合组上述病理变化均有不同程度的改善。见图1。

2.3 各组心肌组织CD31、VEGF蛋白表达情况及MVD比较

免疫组织化学染色显示，模型组大鼠心肌组织CD31、VEGF吸光度较假手术组降低，且磷酸肌酸钠组及联合组较模型组升高，且联合组显著高于磷酸肌酸钠组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2，表2。模型组大鼠心肌组织MVD较假手术组降低，且磷酸肌酸钠组及联合组较模型组升高，且联合组显著高于磷酸肌酸钠组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

目前对于心肌梗死的常规治疗方式主要是通过抗血小板聚集、早期溶栓、冠状动脉介入治疗等开通闭塞血管，改善心肌灌注，最大程度挽救濒死心肌[8]。磷酸肌酸钠作为一种外运行磷酸肌酸的高效能物质，具有显著的心肌细胞代谢、心肌细胞功能保护作用，已广泛用于临床心血管疾病的治疗，如充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等[9]。

近年来中医药在心血管疾病治疗方面取得一定的进展，中医学理论将心肌梗死归属于“喘症、厥心痛、胸痹”等范畴，其病位在于心、血脉，《素问·痹论篇》中记载：“寒邪凝滞脉中致气血壅阻滞寒，气机不畅则发为疼痛;寒邪凝滞脉外使脉络拘挛蜷缩，气血不荣则为疼痛”。故其主要病机为气虚、血瘀、寒凝等，瘀血阻络、心气虚乏，瘀血阻滞，则脉络不通，故应以活血化瘀通络为主要治療原则[10]。舒血宁注射液是临床常用的活血通络中成药制剂，其是中药银杏叶的提取制剂[11]，且《本草纲目》中记载曰：“银杏叶可补气养心、润肺益肾、健脑醒神、延年益寿”。张建平等[12]研究报道，舒血宁注射液具有活血祛瘀、通脉舒络，通脉止痛，益气健脑等功效，对缺血性中风患者疗效显著。而现代医学研究认为，舒血宁是一种天然的特异性的血小板活化因子拮抗剂，其主要药理成分包括黄酮苷类以及银杏内酯，可有效阻断血小板活化因子受体，抑制血小板活化，继而降低血液黏度，改善患者血液流变状态，抑制微血栓的形成;还具有抗氧化、清除氧自由基的作用，可有效改善组织氧化应激损伤，对缺血区域心肌组织具有显著的保护效应[13-15]。本研究中HE染色显示磷酸肌酸钠组及联合组大鼠心肌组织病理损伤较模型组显著改善;此外，研究报道，黄酮苷类物质可有效恢复冠脉血流量;抑制心肌组织磷酸肌酸激酶的释放，减慢患者心率，降低心肌能耗，缩小心肌梗死面积，抗心肌缺血效应显著[16]。本研究中磷酸肌酸钠组及联合组LVEDd、LVESd较模型组降低，FS、LVEF较模型组升高，且联合组及磷酸肌酸钠组LVEDd、LVESd、FS、LVEF均差异显著。提示舒血宁联合磷酸肌酸钠可有效延缓心肌梗死大鼠心室重构，改善心功能，且疗效显著优于磷酸肌酸钠单用。

目前利用血管再生是治疗缺血性心脏病的新方案，也是心脑血管疾病领域研究的新热点[17]。中医学研究认为，“气血相通，行气通脉、补气活血，脉者血之府也”。因此行气活血之中药均可促进血管再生。张庆勇等[18]研究报道，人参皂苷Rg1可通过促进急性心肌梗死大鼠缺血心肌组织血管新生，重新恢复血液供应，挽救濒死心肌并抑制心肌细胞凋亡，保护缺血心肌，继而有效恢复急性心肌梗死大鼠心功能。微血管密度是目前可直接反映侧支血管形成的最可靠指标，有效评估缺血心肌冠脉侧支血管新生情况[19];VEGF是典型的血管内皮生长因子，也是血管新生不可或缺的关键分子[20]。本研究结果显示，磷酸肌酸钠组及联合组大鼠心肌组织CD31、VEGF吸光度值及MVD较模型组升高，且联合组显著高于磷酸肌酸钠组，提示舒血宁联合磷酸肌酸钠改善心肌梗死大鼠心功能的作用机制与其有效上调心肌组织VEGF蛋白表达，升高微血管密度，促进心肌组织血管新生密切相关。

综上所述，舒血宁联合磷酸肌酸钠有效促进心肌组织缺血区域血管新生，改善心肌梗死大鼠心肌病理损伤，恢复其心功能，疗效显著优于磷酸肌酸钠单用，但有关其具体分子作用机制以及最佳用药剂量仍需开展进一步系统研究确认。

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（2019-09-05收稿 责任编辑：杨觉雄）