山茱萸提取物对认知障碍大鼠海马神经元的保护作用

诸葛秀红　韦日明　刘漫君　朱琳　程子娟　曹娜　李肇蕤　李孟知　夏春波

摘要：【目的】明確山茱萸提取物对认知障碍大鼠海马神经元的保护作用及其机制，为开展中药治疗认知障碍的深入研究提供科学依据。【方法】以柠檬酸铝和亚硝酸钠联合腹腔注射60 d建立40只认知障碍大鼠模型，随机分为模型组及山茱萸提取物低、中、高剂量组，分别以4、8和12 g/（kg·d）的山茱萸提取物连续灌胃4周后，利用Morris水迷宫检测各组大鼠的认知功能，采用尼氏染色法观察大鼠海马神经元存活状态，并以TUNEL法检测大鼠海马神经元的凋亡情况。【结果】与模型组相比，山茱萸提取物高、中剂量组大鼠爬上平台所需时间极显著缩短（P<0.01，下同），跨越平台次数极显著增加;山茱萸提取物低剂量组大鼠爬上平台所需时间与模型组间无显著差异（P>0.05），但跨越平台次数显著增加（P<0.05，下同）。山茱萸提取物高、中、低剂量组大鼠海马CA1区神经元尼氏小体数目明显增加，着色加深，对应的平均光密度值分别为0.46±0.11、0.39±0.06和0.32±0.06，均显著高于模型组;山茱萸提取物低、中、高剂量组大鼠海马CA1区绿色荧光标记的神经元数量逐渐减少，凋亡指数逐渐降低，对应的凋亡指数分别为（24.20±3.45）%、（16.33±5.68）%和（9.56±2.80）%，显著或极显著低于模型组[（38.78±4.36）%]。【结论】山茱萸提取物可有效改善认知障碍大鼠在Morris水迷宫中的游泳轨迹，其海马CA1区神经元尼氏小体数目增加、着色加深，绿色荧光标记的神经元逐渐减少，凋亡指数逐渐降低，即山茱萸提取物对大鼠认知功能的保护作用可能与海马CA1区神经元功能改善有关。

关键词： 大鼠;山茱萸提取物;认知障碍;海马神经元;尼氏小体;凋亡指数

中图分类号： S865.12                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2812-07

Protective effects of the Cornus officinalis Sieb. et Zucc. extract on hippocampal neurons in rats with cognitive impairment

ZHUGE Xiu-hong1， WEI Ri-ming2， LIU Man-jun1， ZHU Lin1，  CHENG Zi-juan3，

CAO Na3， LI Zhao-rui3， LI Meng-zhi3， XIA Chun-bo3*

（1Affiliated hospital of Guilin Medical University，Guilin， Guangxi 541001， China;  2School of biotechnology， Guilin Medical University，Guilin， Guangxi  541004， China; 3Department of Anatomy， Guilin Medical University， Guilin，

Guangxi  541004， China）

Abstract：【Objective】The protective effect of Cornus officinalis Sieb. et Zucc. extract on hippocampal neurons of cognitive impairment rats and its mechanism were studied to provide scientific basis for the further research on the treatment of cognitive impairment with traditional Chinese medicine. 【Method】Forty rats with cognitive impairment were produced by intraperitoneal injection of aluminium citrate and sodium nitrite for 60 d and randomly divided into model， low-dose， medium-dose and high-dose groups of C. officinalis extract. The rats of low-dose， medium-dose and high-dose group were respectively given 4， 8， 12 g/（kg·d） of C. officinalis extract by gavage for 4 weeks. Morris water maze was used to test cognitive function in rats of each group， Nissl staining was used to observe hippocampal neurons survival status and the TUNEL method was used to detect apoptosis of hippocampal neurons in rats. 【Result】Compared with the mo-del group， the time of climbing onto the platform of medium-dose and high-dose groups of C. officinalis extract were highly significantly shortened（P<0.01， the same below） and the number of crossing the platform was highly significantly increased. There was no significant difference between the low-dose group and the model group in the time required to climb onto the platform（P>0.05）， but the number of crossing the platform increased significantly（P<0.05， the same below）. The number of nissl bodies of neurons in the hippocampus CA1 region of the high， medium and low dose groups of C. officinalis extract increased and the staining deepened. The corresponding average optical density values were 0.46±0.11， 0.39±0.06 and 0.32±0.06， respectively， which were significantly higher than the model group. The number of green fluorescently labeled neurons in the hippocampal CA1 area of rats in the low， medium and high dose groups of C. officinalis extract decreased gradually， and the apoptosis index decreased gradually. The corresponding apoptosis indexes were （24.20±3.45）%，（16.33±5.68）% and （9.56±2.80）%， which were significantly lower than those in the model group （38.78±4.36）%. 【Conclusion】C. officinalis extract can effectively improve the swimming track of cognitively impaired rats in water maze， the number of nissl bodies of neurons in the hippocampus CA1 region increases and the staining dee-pens. The number of neurons labeled with green fluorescence gradually decreases and the apoptotic index gradually decrea-ses， so the protective effect of C. officinalis on the cognitive function of rats may be related to the improvement of the function of neurons in the hippocampus CA1 region.

Key words： rats; Cornus officinalis Sieb. et Zucc. extract; cognitive impairment; hippocampal neuron; nissl bodies; apoptesis indexes

0 引言

【研究意义】山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）是名贵的中药材，具有补益肝肾、涩精固脱之功效，常用于治疗眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱及内热消渴等症（许继艳等，2014）。现代医学研究表明，山茱萸可调节免疫、抗肿瘤、抗心律失常及对抗炎症，且可促进自主神经末梢释放乙酰胆碱递质，激活动物体内胰岛β-细胞受体，增加胰岛素分泌，从而具有降低血浆葡萄糖水平等生物活性作用（许继艳等，2014;南美娟等，2018），但其对认知障碍的保护作用及其机制尚不清楚。因此，深入研究山茱萸的生物活性和药理作用具有广阔的应用前景。【前人研究进展】目前，有关山茱萸的研究主要集中在不同部位提取物和化学成分分析方面（Forman et al.，2015;Ahn et al.，2017），尤其在山茱萸调节免疫功能方面的研究较多（郑晓丹等，2015;齐静姣等，2016;张荣博等，2018），内容涉及山茱萸对各种免疫调节因子的作用机制等。有关山茱萸抗肿瘤的研究至今已有较多报道（荆宁宁，2016;Telang et al.，2019），肖鹏等（2017）研究发现以山茱萸灌胃可抑制SD大鼠肝癌组织的生长，其机制可能与上调肿瘤组织B7-H6蛋白表达有关。在山茱萸调节动物体内血糖水平方面，李小可等（2015）研究认为山茱萸提取物可能是通过上调AMPK基因表达以增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗，并抑制异丙肾上腺素（ISO）诱导的脂肪分解。在山茱萸对神经系统的作用方面，丁月霞等（2011）对物理性切断穹隆海马伞的大鼠进行研究，结果表明山茱萸可抑制脑内凋亡信号进一步激活，其效果与上调细胞凋亡抑制因子并下调细胞凋亡促进因子有关;顾海等（2011a）研究报道，山茱萸对脑细胞的保护作用可能与其增加BCL-2蛋白表达和降低NF-κB蛋白表达有关。此外，蒋淑君等（2008）研究证实，山茱萸提取物的补益肾阳效果显著，可使大鼠下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素分泌增加，而减少钙调节蛋白的表达;Bhakta等（2017）从山茱萸果实中筛选出多种对胆碱酯酶（ChE）和β-淀粉样蛋白前体裂解酶1（BACE1）具有抑制作用的化合物，且这些化合物在体外试验中均表現出明显的浓度依赖性;南美娟等（2018）研究表明，山茱萸不同部位提取物对醋氨酚所致急性肝损伤模型小鼠均具有保护作用，且以果核提取物的保护作用最佳，其保肝机制可能与抗氧化应激反应有关。【本研究切入点】认知障碍主要损害部位是大脑海马，而海马神经元是最早最易受损的部位之一（Yabuki et al.，2019）。认知障碍的发生机制较复杂，与β淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成老年斑（Koychev et al.，2018;Du et al.，2019）、雌激素水平下降（Russell et al.，2019）及神经营养因子减少（Heisz et al.，2017）等因素有关，目前治疗药物开发难度大，乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI）虽然在一定程度上可减轻症状，但其治疗效果非常有限。中药具有多靶点和多途径的作用特点，因此明确山茱萸提取物对认知功能是否具有保护作用，对研发阻止或延缓认知障碍发生与发展的药剂具有重要意义。【拟解决的关键问题】采用亚硝酸钠和柠檬酸铝联合给药建立认知障碍大鼠模型，探讨山茱萸提取物对认知障碍大鼠海马神经元的保护作用及其机制，为开展中药治疗认知障碍的深入研究提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

雄性SD大鼠（合格证号SCXK桂2007-0001）由桂林医学院SPF级实验动物中心提供，平均体重200±10 g/只。山茱萸提取物购自上海源叶生物科技有限公司，TUNEL检测试剂盒购自Roche公司，尼氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，柠檬酸铝购自广东翁江化学试剂有限公司，亚硝酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司。主要仪器设备：荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti-SR）、成像系统（Nikon DS-U3）、Morris水迷宫（XR-XM101）、病理切片机（RM2016）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 认知障碍大鼠模型建立及试验分组 认知障碍大鼠模型建立及评价：采用柠檬酸铝[200 mg/（kg·d）]和亚硝酸钠[40 mg/（kg·d）]联合腹腔注射60 d建立认知障碍大鼠模型，应用Morris水迷宫评价大鼠认知能力，其判定标准为：以大鼠从入水到爬上平台的时间（定位航行）、跨越平台的次数（空间探索）两项指标中任意一项与对照组差异具有统计学意义判定为认知障碍。将认知障碍大鼠随机分为模型组（n=10）、山茱萸低剂量组（n=10）、山茱萸中剂量组（n=10）和山茱萸高剂量组（n=10），山茱萸提取物加水定容至1.0 g/mL，低、中、高剂量组认知障碍大鼠分别以4、8和12 g/（kg·d）山茱萸提取物连续灌胃4周，每天1次，正常对照组（n=10）和模型组大鼠灌服生理盐水。各组大鼠灌胃4周后，先应用Morris水迷宫评价大鼠认知能力，再以0.3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，心脏灌注固定，剖解取出脑组织并置于30%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存备用。

1. 2. 2 尼氏染色检测大鼠海马CA1区神经元存活状态 脑组织经常规石蜡切片，脱蜡至水，蒸馏水冲洗，尼氏体染液染色10 min，蒸馏水冲洗，70%乙醇冲洗，95%乙醇使脑组织分化至尼氏体着深蓝色，背景呈浅蓝色或无色，风干后中性树胶封片，于光学显微镜下观察，神经元胞浆内含有的蓝色颗粒即为尼氏体。结果分析：采用HPIAS-1000对尼氏染色结果进行定量分析，检测单位视野中尼氏染色的光密度，以每例样本的平均光密度值作为其测量值。

1. 2. 3 TUNEL法检测大鼠海马CA1区神经元凋亡情况 脑组织经常规石蜡切片，脱蜡至水，PBS（pH 7.4）洗3次，每次5 min，破膜工作液常温孵育20 min，PBS（pH 7.4）洗3次，每次5 min，根据TUNEL试剂盒说明加入试剂1（TdT）和试剂2（dUTP）按2∶29混合，切片平置于湿盒内，37 ℃水浴锅孵育2 h，PBS（pH 7.4）洗3次，每次5 min，加DAPI染液，避光室温孵育10 min，PBS（pH 7.4）洗3次，每次5 min，抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察并采集图像，设不含末端转移酶（TdT）的阴性对照。结果判定：以神经元出现绿色荧光判定为凋亡阳性细胞，在显微镜下随机选择高倍视野进行凋亡细胞计数，凋亡指数（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100。

1. 3 统计分析

以SPSS 17.0对试验数据进行统计分析，其中组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 山茱萸提取物对认知障碍大鼠活动的影响

以山茱萸提取物灌胃4周后，应用Morris水迷宫检测各组大鼠的认知能力，结果（表1和图1）显示，山茱萸提取物可有效改善大鼠在Morris水迷宫中的游泳轨迹。与模型组相比，山茱萸提取物高、中剂量组大鼠爬上平台所需时间极显著缩短（P<0.01，下同），跨越平台次数极显著增加;山茱萸提取物低剂量组大鼠爬上平台所需时间与模型组间无显著差异（P>0.05，下同），但跨越平台次数显著增加（P<0.05，下同）。与对照组相比，各山茱萸提取物剂量组大鼠跨越平台次数极显著减少，而爬上平台所需时间显著或极显著延长。

2. 2 山茱萸提取物对认知障碍大鼠海马CA1区神经元尼氏小体结构的影响

光学显微镜观察结果显示，大鼠海马CA1区神经元内存在着色深浅不一的蓝色块状或颗粒状尼氏小体（图2）。相对于模型组，山茱萸提取物高、中、低剂量组大鼠海马CA1区神经元尼氏小体数目明显增加，着色加深，对应的平均光密度值分别为0.46±0.11、0.39±0.06和0.32±0.06，均显著高于模型组;但与对照组相比，各山茱萸提取物剂量组的平均光密度值显著降低（图3）。

2. 3 山茱萸提取物对认知障碍大鼠海马CA1区神经元凋亡的影响

采用TUNEL法对各组大鼠海马CA1区神经元的凋亡情况进行检测，在荧光显微镜下神经元细胞核显示为蓝色，阳性凋亡神经元细胞核为绿色，凋亡神经元呈散在分布或多个成群分布（图4）。相对于模型组，山茱萸提取物低、中、高剂量组大鼠海马CA1区绿色荧光标记的神经元数量逐渐减少，凋亡指数逐渐降低，对应的凋亡指数分别为（24.20±3.45）%、（16.33±5.68）%和（9.56±2.80）%，显著或极显著低于模型组[（38.78±4.36）%];山茱萸提取物低、中剂量组的凋亡指数显著高于对照组，但山茱萸提取物高剂量组的凋亡指数与对照组相比无显著差异（图5）。

3 讨论

中医认为：认知障碍可分为髓海空虚型、痰阻血瘀型、心肾不交型和肝郁脾虚型等（陈冠勋，2004;徐新菊，2005;赵晓琴，2009）。肾精不足，不能生髓;髓海不足，则脑髓渐空，致元神失养、灵机混乱。王飞和王民集（2018）采用肾气汤加减联合针刺百会和四神聪的方法对180例肾精亏虚型认知障碍患者进行治疗，通过简易精神状态检查表（MMSE）等进行评分，结果发现五神针结合肾气汤加減治疗肾精亏虚型认知障碍患者的效果优于单纯五神针或肾气汤加减治疗。山茱萸为山茱萸科植物的干燥成熟果肉，富含挥发油、有机酸和环烯醚萜苷类等多种化学成分，具有补益肝肾等功效（刘云，2019）。周鲁等（2005）对治疗认知障碍有关的1232剂中药复方426种药物进行对比研究，统计每种药物的使用频率并分析其用药趋向性，结果发现山茱萸位列单味药使用频次前10位。本研究结果表明，山茱萸提取物对亚硝酸钠联合柠檬酸铝腹腔注射致认知障碍大鼠Morris水迷宫定位航行试验和空间探索试验均有明显的改善作用，与模型组相比，大鼠爬上平台所需时间明显缩短，而跨越平台次数明显增加，且随着剂量的增加其改善作用越明显，但具体是哪些有效成分起决定作用有待进一步探究。

顾海等（2011b）研究报道，山茱萸活性成分5-羟甲基糠醛（5-HMF）对H2O2诱导损伤的大鼠海马神经元有保护作用，可改善细胞核膜的完整性，减少胞质内空泡数量和肿胀线粒体数量。孟敏等（2018）在研究山茱萸环烯醚萜苷对认知障碍大鼠学习记忆能力和脑组织病理变化的影响时发现，山茱萸环烯醚萜苷可通过保护神经元并促进胆碱乙酰基转移酶（ChAT）表达以改善大鼠的认知功能。苏亚楠等（2018）研究表明，山茱萸多糖对Aβ1-40致学习记忆障碍大鼠行为学有改善作用，其机制可能与降低海马区、糖原合成酶激酶（GSK-3β）蛋白表达量有关。本研究结果显示，山茱萸提取物对认知障碍大鼠行为学的改善作用与海马神经元功能状态有关。相对于模型组，山茱萸提取物高、中、低剂量组大鼠海马CA1区神经元尼氏体数目均增加，而绿色荧光标记的阳性神经元数目逐渐减少，凋亡指数逐渐降低，提示海马神经元在山茱萸改善大鼠认知能力的过程中发挥重要作用。神经系统炎症仅是发生于认知障碍晚期的一种并发症，脑内沉积老年斑块周围的小胶质细胞和星型胶质细胞活化程度高，极易产生许多与认知障碍有关的细胞因子，如白细胞介素-1（IL-1）及肿瘤坏死因子（TNF-α）等（Gyoneva et al.，2016）。山茱萸提取物对认知障碍大鼠行为学和海马神经元存活的影响可能是中医学补肾填髓效应发挥了作用，但其具体机制有待进一步研究。

4 结论

山茱萸提取物可有效改善认知障碍大鼠在Morris水迷宫中的游泳轨迹，其海马CA1区神经元尼氏小体数目增加、着色加深，绿色荧光标记的神经元逐渐减少，凋亡指数逐渐降低，即山茱萸提取物对大鼠认知功能的保护作用可能与海马CA1区神经元功能改善有关。

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（責任编辑 兰宗宝）