miR`-375对结直肠癌细胞侵袭迁移影响及其与Notch2通路蛋白的关系

黄巧　孟海宁　任静　罗路　齐宏　沈若武

[摘要]目的探討microRNA`-375（miR`-375）对结直肠癌（CRC）细胞侵袭迁移的影响及该影响与Notch2通路蛋白的关系。方法将表达miR`-375的慢病毒转染入人CRC细胞HCT`-116细胞中作为实验组，将空载慢病毒转染入HCT`-116细胞中作为阴性对照组（NC组），未转染HCT`-116细胞作为空白组，采用实时荧光定量PCR（qRT`-PCR）方法检验转染效率，Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力，Western Blot方法检测Notch2通路蛋白的相对表达。再将Notch2小干扰RNA（siRNA）转染入HCT`-116细胞中作为Notch2`-siRNA组，将阴性对照转染入HCT`-116细胞中作为Notch2阴性对照组，未转染HCT`-116细胞作为空白组，采用Western Blot方法检测3组细胞Notch2蛋白表达量，采用Transwell小室实验进一步验证Notch2表达的改变对CRC细胞侵袭迁移的影响。结果CRC细胞中miR`-375表达明显低于人正常结直肠黏膜细胞（t=33.00，P<0.05）。使HCT`-116细胞中的miR`-375过表达后，与NC组和空白组相比，细胞的侵袭、迁移能力均下降（F=223.40～894.16，P<0.05），且Notch2通路蛋白相对表达量下降（F=100.63，P<0.05）。将Notch2下调后，与Notch2阴性对照组和空白组相比，Notch2`-siRNA组细胞的侵袭迁移能力下降（F=144.31～197.54，P<0.05）。结论上调miR`-375表达可以抑制CRC细胞的侵袭迁移，这一作用可以通过调控Notch2来实现。

[关键词]结直肠肿瘤;微RNAs`-375;Notch2;肿瘤转移

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of microRNA`-375 （miR`-375） on the invasion and migration of colorectal cancer （CRC） and its association with Notch2 pathway protein. MethodsHuman CRC HCT`-116 cells transfected with the lentivirus with miR`-375 expression were included as experimental group， HCT`-116 cells transfected with the empty lentivirus were included as negative control group （NC group）， and untransfected HCT`-116 cells were included as blank group. Quantitative real`-time PCR was used to measure transfection efficiency， Transwell chamber was used to evaluate cell invasion and migration， and Western Blot was used to measure the relative expression of Notch2 pathway protein. HCT`-116 cells transfected with Notch2 small interfering RNA （siRNA） were included as Notch2`-siRNA group， HCT`-116 cells transfected with negative control were included as Notch2 negative control group， and untransfected HCT`-116 cells were included as blank group. Western Blot was used to measure the protein expression of Notch2， and Transwell chamber was used to verify the effect of the change in Notch2 expression on the invasion and migration of CRC. ResultsCRC cells had significantly lower expression of miR`-375 than normal human colorectal mucosal cells （t=33.00，P<0.05）. Compared with the NC group and the blank group， the HCT`-116 cells with miR`-375 overexpression had significant reductions in the invasion and migration of cells （F=223.40-894.16，P<0.05） and the relative expression of Notch2 pathway protein （F=100.63，P<0.05）. Compared with the Notch2 negative control group and the blank group， the Notch2`-siRNA group with downregulated Notch2 had significant reductions in the invasion and migration of cells （F=144.31-197.54，P<0.05）. ConclusionUpregulation of miR`-375 expression can inhibit the invasion and migration of CRC cells， which can be achieved by the regulation of Notch2.

[KEY WORDS] colorectal neoplasms; microRNAs`-375; notch2; neoplasm metastasis

结直肠癌（CRC）是第三大常见的癌症，也是男性和女性癌症死亡的第三大原因，已知有多种致瘤途径均可导致CRC的发生[1]。侵袭和迁移是CRC致死的主要原因，但其机制仍未明确[2`-3]。因此，从分子水平研究CRC侵袭迁移的影响因素意义深远。微小RNA（miRNA）是一种小型非编码RNA分子，它参与基因沉默和癌症恶化的调节[4]，同时也可以影響细胞功能包括恶性转化、血管生成、细胞生长以及炎症反应等[5]。其中，miR`-375是一种多功能的miRNA，参与胰岛发育、葡萄糖体内平衡、黏膜免疫、肺表面活性剂分泌以及肿瘤发生等。最近的研究结果显示，miR`-375在多种癌症中表达量显著降低，并可通过抑制星形细胞上调基因`-1（AEG`-1）、Yes相关蛋白1（YAP1）、胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）和3`-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶`-1（PDK1）等几个重要的致癌基因来发挥抑癌作用[6]。Notch信号通路是一种进化上保守的细胞信号通路，它可以对癌症发生、癌症干细胞生物学特性和肿瘤血管生成产生影响，其在肿瘤学领域作为潜在治疗靶点具有重要地位[7]。Notch信号通路由Notch受体、DSL蛋白配体（Delta/Serrate/lag2）和细胞内效应分子组成，Notch受体又可以分为Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，其中Notch2受体与多种癌症密切相关。而Notch2的表达与CRC密切相关，并可能在肿瘤抑制中发挥作用。本实验研究miR`-375、Notch2及CRC间的关系，分析其可能的分子机制，为CRC的分子靶向治疗提供参考。

1材料与方法

1.1实验材料

人类CRC细胞株HCT`-116及人正常结直肠黏膜细胞（FHC）购自吉凯基因化学技术有限公司;胎牛血清、RPMI`-1640培养基、胰蛋白酶及青霉素`-链霉素双抗购自北京索莱宝科技有限公司;miR`-375慢病毒（HIV）及空载病毒（HIV）购自吉凯基因化学技术有限公司;聚凝胺购自北京索莱宝科技有限公司;Li`-pofectamineTM2000、Trizol试剂购买于美国Invitrogen公司;PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq RR420A试剂盒购自大连Takara公司;基质胶购自美国BD公司;Transwell小室购自美国康宁公司;Notch2小干扰RNA（siRNA）及阴性对照购自Santa Cruz公司;Notch2一抗购自CST公司;β`-actin一抗、二抗购自Absin公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养用含体积分数为0.10胎牛血清、10 g/L青霉素`-链霉素双抗的RPMI`-1640培养液培养细胞。在37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养，每24 h更换1次培养液，倒置显微镜下观察细胞生长状态。当细胞融合度达80%左右时传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2实时荧光定量PCR（qRT`-PCR）方法检测miR`-375表达量收集细胞，根据TRIzol试剂说明书提取细胞总RNA，应用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）将其反转录成cDNA，应用SYBR Premix Ex Taq RR420A进行qRT`-PCR （bio`-rad CFX96）检测细胞中miR`-375的表达。反应条件：95 ℃，30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环;60 ℃、15 s。实验重复3次。实验所用引物来自上海生物技术工程有限公司。其序列见表1。

1.2.3miRNA转染及表达检测将生长状态良好HCT`-116细胞接种于96孔板，每孔5×104个，培养24 h。实验分为实验组、阴性对照（NC）组和空白组，每组设3个复孔。将聚凝胺按1∶2 000稀释，每孔10 μL，与miR`-375慢病毒共同转染HCT`-116细胞作为实验组，与空载慢病毒共同转染HCT`-116细胞中作为NC组，未转染HCT`-116细胞作为空白组。感染复数（MOI）值为25。加入培养液后将96孔板放于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养10 h，移除培养液，每孔加入100 μL新的培养液，培养箱中继续培育24 h，应用qRT`-PCR方法检测3组细胞miR`-375的表达量。结果取3个复孔平均值，实验重复3次。

1.2.4siRNA转染及表达检测将生长状态良好的HCT`-116细胞接种于6孔板中，每孔5×105个，培养24 h。实验分为Notch2`-siRNA组、Notch2阴性对照组和空白组。将Notch2`-siRNA和阴性对照分别与Li`-pofectamineTM2000按照20∶1的比例混合后加入到两组HCT`-116细胞中，每孔105 μL混合物，分别作为Notch2`-siRNA组和Notch2阴性对照组，未转染细胞为空白组。将3组细胞加入含体积分数0.10胎牛血清的RPMI`-1640培养液2 mL，放于37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养6 h，移除培养液，每孔加入2 mL新培养液。48 h后收集细胞，应用Western Blot方法验证Notch2蛋白是否下调成功。实验重复3次。

1.2.5Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力向24孔板中加500 μL含体积分数0.15血清的RPMI`-1640培养液，将Transwell小室放于孔中，取生长状态良好的细胞接种于Transwell小室的上室，每孔5×104个，加200 μL无血清的RPMI`-1640培养液于上室;将24孔板置培养箱培育24 h后取出，以PBS清洗小室，用棉签轻轻拭去上室细胞，甲醇固定15 min，结晶紫染色15 min，PBS溶液清洗3次，取出拍照，对照片中细胞计数，进行统计学分析。侵袭实验：将基质胶用RPMI`-1640培养液稀释10倍后，每个小室内加入100 μL，放入培养箱4 h后取出，将小室中液体轻轻吸出，其余步骤同迁移实验。48 h后观察并拍照，计数细胞，进行统计学分析。实验重复3次。

1.2.6Western Blot方法检测Notch2蛋白相对表达量提取细胞蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度，用Western Blot方法分别检测实验组、NC组、空白组细胞以及Notch2`-siRNA组、Notch2阴性对照组、空白组细胞的Notch2蛋白表达。将50 μg蛋白在SDS`-PAGE凝胶上电泳并分离，将分离后的蛋白分子转至PVDF膜上，于低速摇床上用含脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h。加入Notch2一抗（1∶1 000），4 ℃过夜孵育。加入二抗（1∶3 000）孵育2 h。用ECL发光液在显影仪中进行目的蛋白显影并保存图片。分析条带灰度，以目的条带灰度值/内参条带灰度值表示Notch2蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.3统计学分析

应用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析。计量资料结果以±s形式表示，多组数据间比较采用方差分析，两组数据间比较应用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1miR`-375对各指标检测结果的影响

2.1.1HCT`-116细胞、FHC细胞miR`-375表达比较HCT116细胞、FHC细胞miR`-375相对表达量比较差异有显著性（t=33.02，P<0.05）。见图1。

2.1.2各组miR`-375表达比较实验组HCT`-116细胞miR`-375表达量较NC组明显增加，差异有统计学意义（F=8 413.05，P<0.05）;NC组与空白对照组比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

2.1.3miR`-375对细胞迁移数目影响实验组迁移细胞数显著少于空白组和NC组，差异有统计学意义（F=223.40，P<0.05），空白组与NC组比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

2.1.4miR`-375对细胞侵袭数目影响实验组侵袭细胞数显著少于空白组和NC组，差异有统计学意义（F=894.16，P<0.05）; 空白组与NC组比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。

2.2下调Notch2对各指标检测结果影响

2.2.1各组Notch2相对表达量比较空白组和NC组细胞Notch2蛋白相对表达量高于实验组，差异有统计学意义（F=100.63，P<0.05）;空白组与NC组Notch2蛋白相对表达量比较差异无显著性（P>0.05）。见表1、图2。

2.2.2Notch2对细胞迁移和侵袭影响Western Blot结果显示，空白组（A组）和Notch2`-阴性对照组（B组）的Notch 2蛋白相对表达量高于Notch2`-siRNA组（C组），差异有统计学意义（F=805.35，P<0.05），空白组与Notch2`-阴性对照组比较差异

214青岛大学学报（医学版）55卷

无显著性（P>0.05）。见表2、图3。Transwell迁移实验显示，Notch2`-siRNA组迁移细胞数显著少于空白组和Notch2`-阴性对照组，差异有统计学意义（F=197.54，P<0.05），空白组与Notch2`-阴性对照组比较差异无显著性（P>0.05）。见表2。Transwell侵袭实验显示，Notch2`-siRNA组侵袭细胞数显著少于空白组和Notch2`-阴性对照组，差异有统计学意义（F=144.31，P<0.05）;空白组与Notch2`-阴性对照组比较差异无显著性（P>0.05）。见表2。

3讨论

miRNA是一组内源性的、进化保守的非编码小分子RNA，它在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。miRNA是重要的调控RNA，在各种生物过程和人类疾病中控制基因表达，可以通过翻译抑制或mRNA降解来调节转录后的基因表达[8]。近年来，miRNA在癌症中的作用得到了广泛的研究，多项研究表明，miRNA可以通过调节细胞增殖、细胞黏附、凋亡和血管生成而发挥致癌或抑癌作用[9]。有研究进一步表明，miRNA作为癌症研究中的诊断及预后标志物有很大意义。在多种癌症中miR`-375表达紊乱，miR`-375在胃癌、胶质瘤、CRC、胰腺癌、肝癌、鳞癌中呈低表达，而在甲状腺髓样癌、乳癌和前列腺癌中高表达[10]。另有研究表明，miR`-375作为一种肿瘤抑制因子，可以抑制某些类型癌症的细胞生长和肿瘤进展[11]。与正常人类结直肠组织相比，miR`-375在人类CRC细胞系和组织中大多数呈低表达[12]，这表明miR`-375的变化可能与CRC的发生发展有关。以往的研究证明，miR`-375可以通过调节KLF4来抑制CRC的增殖[13]，也可以通过调节pi3k/akt信号通路抑制CRC细胞的生长[12]。还有研究发现，hsa`-miR`-375和hsa`-miR`-133a`-3p可能为CRC的新标记物[14];miR`-375作为抑癌基因起着重要作用，如能够增加卵巢癌细胞的凋亡[15]。但在前列腺癌中miR`-375却促进了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[16]，提示miR`-375在肿瘤细胞中的作用具有组织细胞特异性。本文研究miR`-375对CRC细胞侵袭与迁移能力是否有影响，研究结果表明miR`-375过表达对于CRC细胞的侵袭转移能力具有抑制作用，这与miR`-375为抑癌基因的研究结果相一致。

然而，在CRC中miR`-375的具体作用机制仍不清楚。为了阐明miR`-375调节CRC侵袭迁移的潜在分子机制，本文研究了miR`-375的可能通路。Notch信号通路是一个高度保守的细胞信号系统，在细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能中均发挥着重要作用[17]。Notch信号轴由Notch受体、DSL蛋白配体和细胞内效应分子组成，Notch受体又分为Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，其中Notch2参与多种癌症的发生，促進肿瘤生长，降低化疗敏感性[19]。目前，Notch信号通路被认为在多种癌症中发挥作用，是调节正常肠黏膜细胞谱系分化的必要条件[19]。以往研究显示，CRC中Notch信号调节异常，且该异常贯穿整个肿瘤发生过程[20]。Notch信号参与CRC的发生和发展，且高表达Notch信号与癌症的进展和转移相关[21]。使用基因分析软件筛选miR`-375的可能性直接靶点，发现Notch与Wnt通路中的NOTCH2、RBPJ等基因包含了与miR`-375直接结合的位点[22]。有研究显示，拮抗Notch2/Notch3能有效地治疗包括乳癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌在内的多种上皮肿瘤[23]，下调Notch2还可以抑制胃癌的增殖、侵袭和转移，也可以抑制肿瘤干细胞的性状和膀胱癌的进展[24]。在以往CRC基因组突变谱的研究中还发现了融合基因PHKB`-NOTCH2[25]。因此，本文选取Notch2作为研究对象。已有研究显示，Notch2表达与CRC密切相关，并可能在肿瘤抑制中发挥作用[26]。本文实验结果显示，miR`-375过表达能够抑制Notch2通路蛋白的表达，进而抑制CRC细胞的侵袭和迁移;将Notch2用siRNA下调后，CRC的侵袭迁移能力下降，二者的作用是一致的。

以上結果表明，miR`-375是调节CRC侵袭转移的靶点，它的作用可以通过调控Notch2实现。本文尽管明确了CRC细胞中miR`-375与Notch2之间的靶向关系，但miRNA在肿瘤发生发展中发挥作用的机制十分复杂，Notch通路亦复杂多变，还需要更深入地研究，才能为临床上肿瘤的治疗提供更多的可能性治疗靶点。

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