基于紫外荧光法测量水体叶绿素含量

何胜辉 杨云开 元德仿 舒易强

（七善科技有限公司，广东 深圳 518132）

作为水体初级生产者的浮游藻类植物来说，其体内含有大量的叶绿素，而叶绿素是对水体中浮游植物进行一定光合作用的一类色素总称。不同的浮游藻类植物中叶绿素含量各不相同。可通过利用适宜波长的光源致使叶绿素发出荧光现象，根据浮游植物发出的荧光强度推算其在水中的繁衍浓度。

1 基于紫外荧光法测量水体叶绿素含量的原理及方法

水体中的浮游植物在进行光合作用时，其体内的叶绿素分子通过对光能的吸收作用，将吸收的能量一部分作为光合作用所需的能量来源，另一部分则通过热能的形式消耗掉，最后剩余的部分才会通过荧光的形式表现出来。基于能级跃迁机理，观察浮游植物叶绿素分子的荧光光谱与能量吸收光谱，发现荧光物质在光吸收过程中会出现一系列不同的吸收带，但只会出现一个峰带。从根本上讲，呈自然密度繁衍的浮游植物其吸收光谱的特性基本上由其体内所含的叶绿素含量决定[1]。当使用特定波长的光照射浮游植物水溶液后，会激发浮游植物发出比入射光波长更长的荧光，其发出的荧光强度F的计算公式为：

式中：

K—荧光测量仪的仪器系数（mol/W）；

ψ—所测荧光物质的荧光系数（W/mol）；

I0—入射光的强度（W）；

ε—所测荧光物质的摩尔吸收系数（m2/mg）；

C—所测荧光物质的浓度（mol/L）；

b—样品的光程（cm）。

对公式 （1） 进行换算整理，得出公式 （2） ，可清晰的表现出所测的荧光物质浓度C与荧光强度F之间的对数关系：

由所测的荧光物质浓度C与荧光强度F之间的换算公式发现，在荧光测量仪和需要测定浓度的荧光物质都确定的情况下，式中的k、ψ、I0、ε都将为确定的常数，由此也可确定A、B、D的值。所以，在水体的浮游植物中，其叶绿素产生的荧光强度在一定程度上和水体所含的叶绿素浓度呈相关的线性关系。因此，荧光测量仪通过检测器将接收到的荧光转变为电信号，然后根据接收到的电信号大小计算待测水体中浮游植物所含的叶绿素含量[2]。

2 影响荧光强度的主要因素

2.1 激发光对荧光强度测量结果的影响

虽然提高激发光的入射强度与入射时间，在一定程度上可以增强紫外荧光法测量及分析的灵敏度，但由于待测水体中的叶绿素在长时间的强烈激发光照射下容易发生降解反应，从而造成所测量的荧光强度的不准确性，引起测量结果的偏低。因此，应通过提高荧光测量仪探测器的灵敏度来增强紫外荧光法测量及分析的灵敏度，而不能通过片面的增强激发光入射强度的方法。除此之外，需要注意的一点是，在进行紫外荧光法测量水体中叶绿素含量时，要尽量缩短激励光对待测水体的照射时长。

2.2 温度对荧光强度测量结果的影响

虽然荧光在辐射过程中不受水体温度变化的影响，但水体温度的变化会影响物质的去活化过程，水体温度越高，去活化的概率就越大。但需要注意的是，温度过高也会使水体中的叶绿素发生降解反应。当待测水体的温度下降时，溶液的黏度就会变大，大大降低了荧光分子与溶剂分子发生碰撞的概率，降低了去活化的概率。因此，当待测水体的温度升高时，会大大降低荧光物质产生荧光现象的效率及其所产生的荧光强度。所以，在进行测量水体中叶绿素含量时，要尽量配备恒温装置，降低温度对荧光强度的影响，提高测量结果的准确性。除此之外，还可以通过补偿温差的办法对温度造成的影响进行一定的降低。

3 基于紫外荧光法测量水体叶绿素含量的影响因素

（1） 水体浑浊度的影响。由于水体中的悬浮物对荧光具有较强的散射作用，当水体的浑浊度越大，悬浮颗粒物就越多，散射作用就越强烈，基于紫外荧光法测量水体叶绿素含量的结果就越偏高。

（2） 水体温度的影响。由于叶绿素的结构较不稳定，高温下容易发生降解反应，造成测量结果偏低[3]。因此利用紫外荧光法测量水体叶绿素时，最佳的水体温度应控制在15～37 ℃。

（3） 水体pH酸碱度的影响。由于叶绿素的易降解特性，不论是在过碱或过酸的环境下都极不稳定，因此，水体的pH值对紫外荧光法测量叶绿素含量的结构会造成一定的影响，最佳的水体pH值应控制在6.0～9.5范围内。

（4） 水体光照的影响。光照主要包括光照时间和光照强度两个因素，当光照时间较长，光照强度较强时，叶绿素极易因光发生降解反应，造成测量结果偏低。因此，通常情况下，会在荧光测量仪上加装避光罩，在一定程度上避免光照的影响，提高测量数据的准确性。

4 基于紫外荧光法测量水体叶绿素含量的操作注意事项

4.1 采用稳定入射光源，保持激发光的单色性

由于波长λ的函数与ε摩尔吸光系数存在一定的相关性，当改变波长λ的值时，ε系数也会随之发生改变，不再是个固定不变的常数，由此它们之间的线性关系也将不复存在。而激发光无法满足绝对的单色性，荧光测量仪只能尽量使用小波长的复合光作为激发光源。因此，在进行测量时，可以通过选择适宜的激发光源与滤光片等方法，获得较为稳定的单色光源。

4.2 保证待测水质的均匀性

基于紫外荧光法测量水体叶绿素含量的郎伯-比尔定律只能用于测量均匀稳定的溶液，因此要尽可能地保证待测溶液中没有悬浊颗粒或乳浊液等杂质存在。在使用荧光测量仪在线监测时，可以在仪器上加装一过滤净化装置，过滤水体杂质，降低悬浊物的散射作用，保证所得线性关系的准确性。

4.3 降低散射光对荧光测量结果的影响

在对待测水质的荧光强度进行测量时，由于激发光对待测水体中的胶粒或盛放容器等会产生一定的散射光现象，从而限制与干扰了紫外荧光测量仪的测量灵敏度。在测量时可选择适宜波长的激发光，减小或排除水体产生的散射光作用，以高测量结果的准确性。一般情况下，水体产生的荧光强度都较小，因此在进行荧光测量时可通过选择适宜的狭缝宽度，既能满足荧光强度的测量要求，又能尽量减少散射光带来的影响。

5 结语

叶绿素荧光测量仪可在线实时监测湖泊、海洋等各种不同的水体。本文基于紫外荧光法对水体中的叶绿素含量进行测定，通过使用适宜波长的光源致使浮游植物体内的叶绿素发出荧光现象，快速检测浮游植物发出的荧光强度，利用荧光强度与叶绿素浓度之间的线性关系，推算其在水中的繁衍浓度，从而得出水体中的叶绿素含量。