银盏心脉滴丸对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞线粒体功能的影响

李 洁，刘如秀

（中国中医科学院广安门医院，北京 100053）

冠心病是重大心血管疾病，具有发病率高、致死率高的特点[1]。文献表明，该病发生机制主要是氧自由基、钙超载、能量代谢紊乱、炎症反应浸润、细胞凋亡，而其中能量代谢紊乱碍是当前研究热点，被认为是缺血/再灌注损伤的初始环节。最新研究表明，中药可提高心肌细胞线粒体呼吸酶复合物活性、心肌线粒体跨膜电位（MMP）、心肌Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，改善缺血心肌能量代谢。因此，通过中药调控心肌能量代谢防治缺血性心脏病具有重要的研究意义和应用价值。

银盏心脉滴丸是以灯盏细辛、银杏叶、丹参、天然冰片等中药制成的，具有活血化瘀，通脉止痛作用。文献表明，本药能增加冠脉血流量，降低心肌氧耗，有效抑制心电图S-T段抬高，防治心肌缺血再灌注损[2-3]。目前，该药已被广泛用于治疗冠心病、心绞痛等的治疗[4-5]，但由于其有效成分较复杂，对分子水平研究仍不够深入。因此本实验采用缺氧/复氧诱导H9c2细胞损伤模型，从改善线粒体功能及减少细胞凋亡2个方面探究银盏心脉滴丸对H9c2细胞的作用及相关机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 银盏心脉滴丸（批号20170602），由贵州神奇药业提供；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、青、链霉素，购于北京索莱宝公司；胎牛血清（FBS），购于美国Gibco公司；XF细胞线粒体耗氧量检测试剂盒，购于美国Seahorse bioscience公司；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒，购于罗氏公司。

1.2 细胞 H9C2大鼠胚胎心肌细胞系，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心（Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC）。

1.3 仪器 CO2恒温培养箱，Thermo公司；光学倒置显微镜Olympus IX70，奥林巴斯日本；XF96海马生物能量测定仪、XF 96细胞培养板和探针敏感器，美国Seahorse Bioscience公司；流式细胞仪，BD公司。

2 方法

2.1 细胞培养 H9c2细胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU/L、链霉素100 mg/L，DMEM高糖培养基培养。细胞置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，待80%～90%融合时，弃去旧培养基，PBS清洗，0.25%胰酶消化。在显微镜下观察细胞开始变圆时加入DMEM完全培养基终止消化，1380 r/min离心5 min。弃上清，加入完全培养基重悬备用。

2.2 分组及模型制备 将细胞分为对照组、模型组（缺氧/复氧）、银盏心脉滴丸含药血清组（30 min、12 h和24 h）。待细胞贴壁后，用预先N2饱和的缺氧培养基置换旧培养基，于密闭盒中持续通以30倍体积约1 L的95%N2-5%CO2混合气体，充分排尽密闭盒中残余的氧气，后用止血钳钳闭进出管道，造成缺氧条件，放入培养箱中培养1 h，；再取出换成高糖培养基，开放通气管道，以恢复氧和糖供应培养3 h，制备细胞损伤模型。

2.3 含药血清的制备 参照文献，10只大鼠，购自于北京斯贝福生物技术有限公司。银盏心脉滴丸组大鼠按393.75 mg/kg（相当于临床用量5倍）的剂量灌胃给药。灌胃体积按1 0m L/kg计算。各组灌胃给药每日2次。连续给药7 d，腹主动脉取血，离心，制备血清，－80℃保存。

2.4 Seahorse能量测定仪检测H9c2细胞线粒体能量代谢 将H9c2细胞以5 000～40 000个细胞/孔，共80μL/孔。种细胞于细胞板中，保证背景孔无细胞（A1，A12，H1，H12），接种 80 μL 培养基，于细胞培养箱中过夜。取XF96探针板，每孔加入200μL标准液，放好上板，保证探针浸没在标准液内，在无CO2的37℃培养箱中使探针水化24 h。用XF检测培养基清洗细胞2遍，最终保留175μL。终放入37℃incubator孵育1 h。

检测前，将试剂盒中的 oligomycin、FCCP、Rotenome/AntimycinA（R/A）配制母液。将终浓度为1 μmol/L oligomycin、1μmol/L FCCP，0.5 μmol/L R/A加载到探针板的加药槽内。将探针板放入机器中约20 min。平衡结束后，将底板换为种有细胞的培养板，根据前期设置好的程序分不同时段加入对应的抑制剂进行上机检测。

2.6 流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡 将H9c2细胞以1×106个/mL的密度种于培养皿中，给药及造模情况同“2.2”项下。用PBS缓冲液清洗后加入胰酶消化，DMEM完全培养基终止消化并轻柔吹打促进细胞消化脱壁。将所得消化液与回收的培养液合并于离心管中，1 500 r/min离心5 min收集细胞。每管加入Binding Buffer 500μL重悬细胞，轻轻吹匀。最后加入Annexin V-FITC和PI溶液各5μL混匀，50度加热5min，室温避光染色15 min。用流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡。

2.7 统计学方法 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS22.0数据统计软件，对数据进行正态性检验，采用单因素方差分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体呼吸曲线的影响 本实验选取银盏心脉滴丸按照不同时间处理细胞，分别诱导细胞0.5、12和24 h进行检测，在A、B、C药孔中分别加入寡霉素、解偶联剂FCCP、鱼藤酮和抗霉素A（n=4）。据图可得，当加入寡霉素后，ATP的生成会被阻断，I/R模型组较正常组呼吸曲线下移，银盏心脉组呼吸曲线上升。当加入FCCP后，可使线粒体呼吸达到最大值，I/R模型组较正常组呼吸曲线下移，银盏心脉组呼吸曲线上升。而当加入鱼藤酮和抗霉素A后，线粒体不能维持呼吸功能的正常进行，抑制氧化磷酸化过程。（见图1）

图1 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体呼吸曲线的影响

3.2 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体基础呼吸和ATP生成量的影响 结果显示，与正常组对比，I/R模型组使基础呼吸降低[I/R：（78.3±2.5）vs.Ctrl：（110.6±1.8），n=4，P＜0.05]，加入不同作用时间的YZXM均会刺激心肌细胞增加基础呼吸，[I/R：（78.3±2.5）vs.YZXM+30 min：（98.6 ±2.75）；YZXM+12 h：（85.6±1.3）；YZXM+24 h：（99.3±2.65），n=5，P<0.01]，见图 2。

与正常组对比，模型组心肌细胞线粒体ATP生成量明显降低[Ctrl：（65.67±2.87）vs.I/R：（49.17±2.96）]，加入不同作用时间的YZXM可增加心肌细胞线粒体 ATP 含量[YZXM+30 min：（58.45±2.8）；YZXM+12 h：（54.3±1.5）；YZXM+24 h：（57.53±2.34），n=4，P＜0.05]，见图3。

图2 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体基础呼吸的影响

图3 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体ATP生成量的影响

3.3 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体呼吸储备能力的影响 结果表明，与空白对照组比较，模型组线粒体呼吸储备能力降低（P＜0.05）。给予银盏心脉滴丸30 min，24 h后，可以显著上升线粒体呼吸储备能力（P＜0.01），给予银盏心脉滴丸12 h，线粒体呼吸储备能力下调，究其原因，与适宜浓度相关，见图4。

图4 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体呼吸储备能力的影响

3.4 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体最大呼吸的影响 结果显示，与空白对照组比较，模型组线粒体最大呼吸显著下降，银盏心脉滴丸处理初期，最大呼吸变化显著，12 h后最大呼吸降低明显，至 24 h时，最大呼吸上升（n=4，P<0.05），见图5。

3.5 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞凋亡的影响 与对照组相比，模型组细胞凋亡指数均明显高于对照组（I/R：55.8±0.56 vs.Ctrl：11.3±0.76，n=3，P<0.01）。与模型组相比，银盏心脉滴丸作用于心肌细胞凋亡细胞百分率降低（YZXM+30min：11.8±0.69；YZXM+12h：16.1±0.94；YZXM+24h：16.1±0.71，n=3，P<0.01），以上结果提示银盏心脉滴丸可减少缺氧/复氧心肌细胞凋亡比例，见图6。

图5 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞线粒体最大呼吸的影响

图6 不同作用时间的银盏心脉滴丸对心肌细胞凋亡的影响

4 讨论

心肌缺血的主要特征表现为严重缺氧、酸中毒、能量消耗和离子平衡的改变，进而导致心脏功能发生障碍，最终诱导细胞发生死亡。研究表明，在心肌细胞中，线粒体很丰富，以氧为主要底物，因此线粒体在缺血/缺氧/复氧中的作用尤为重要[6]。诸多研究发现线粒体功能障碍是引起心肌缺血损伤和诱导缺血心肌细胞调亡的重要病理机制之一，包括线粒体ATP生成减少、Ca2+超载、活性氧（ROS）生成、线粒体片段化及mPTP的持续开放等[7]。因此，研究线粒体对心肌缺血损伤的分子机制，对改善冠心病患者的临床及预后具有重要意义。

线粒体功能与呼吸链结构密切相关。线粒体呼吸链位于线粒体内膜上，由NADH-Q氧化还原酶、琥珀酸-Q氧化还原酶、UQ-细胞色素C氧化还原酶，细胞色素C氧化酶，ATPase（ATP合成酶复合物V）组成[8]。Seahorse能量测定仪可检测细胞线粒体的能量代谢，实时动态监测培养环境中氧分子浓度，从而反映线粒体耗氧情况。寡霉素可抑制线粒体ATP的合成，从而得出线粒体合成ATP相关的耗氧率。FCCP为解偶联剂，加入FCCP后线粒体不生成ATP但电子传递持续进行，电子传递链处于最大激活状态，使OCR达到最大。抗霉素和鱼藤酮同时加入可完全抑制线粒体氧化磷酸过程。储备能力的大小与细胞应激状态下自身的调节适应能力相关，储备能力的损伤或丧失将最终导致细胞死亡[8]。本研究运用生物能量检测仪检测结果显示，缺氧/复氧的心肌细胞其线粒体基础呼吸、ATP生成、最大呼吸能力提高，呼吸储备能力均下降。

银盏心脉滴丸主要由灯盏细辛、银杏叶、丹参及天然冰片组成。灯盏细辛，性味甘温，具有解表散寒，活血化瘀，止痛消瘀功能。现代药理研究表明灯盏细辛具有抗炎、抗血小板聚集[9-10]、抑制血栓形成、防治心肌缺血[11]，改善血液流变学[12]等作用；银杏叶，甘、苦、涩，平。归心、肺经。具有敛肺，平喘，活血化瘀，止痛作用。研究表明可改善缺血心肌[13]，降低心律失常的发生率[14]，扩张冠脉，清除自由基[15]、抗脂质过氧化、抗血小板活化因子[16]、抑制血小板聚集、降血脂等作用；丹参，苦，微寒。归心、肝经。具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦的作用。《本草纲目》记载活血，通心包络。治疝痛。药理研究表明该药可强心，增强心肌收缩力、改善心功能，降低心肌耗氧量[17]，改善微循环状态、减轻动脉粥样硬化、增加冠状动脉流量。全方共奏活血化瘀，通脉止痛之功。研究表明，银盏心脉滴丸能增加冠脉血流量，降低心肌氧耗，减少心肌缺血，有效抑制心电图S-T段抬高，缩小试验性心梗面积。另有研究表明，该药能保护血管内皮免受损伤，抑制平滑肌细胞增殖和血栓形成，从而抑制动脉粥样硬化的形成，显著抑制ADP诱导的血小板聚集，抑制血栓形成，对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。本实验研究表明银盏心脉滴丸通过增加细胞基础耗氧率及最大耗氧率，增加线粒体储备能力，从而增强H9c2细胞抗应激能力，改善H9c2细胞氧化损伤后线粒体能量代谢的状态。

综上所述，本研究基于Seahorse能量测定技术检测线粒体能量代谢和基于流式细胞仪的细胞凋亡检测技术，评价银盏心脉滴丸对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞的保护作用。发现银盏心脉滴丸可以调节线粒体能量代谢、抑制心肌细胞凋亡，从而减轻缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤。但其分子机制仍需进一步研究。