利用根系水粗提物评价香蕉种质对枯萎病的抗性

刘 范, 田 娜, 孙雪丽, 项蕾蕾, 郝向阳, 刘嘉鹏, 赖钟雄, 程春振

(福建农林大学园艺学院/园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

香蕉是全球重要的经济作物和粮食作物[1]，其销量居各类水果之首[2-3].香蕉产业是我国南方亚热带地区重要的农业支柱.近年来,随着人们对香蕉需求量的不断增加，香蕉产业面临前所未有的发展机遇[4].然而，香蕉枯萎病的发生严重制约了香蕉产业的健康发展[5].该病自发现以来，便在全球迅速传播，几乎所有香蕉种植区都受到危害.目前，香蕉枯萎病已成为制约香蕉产业发展的世界性难题[6].

香蕉枯萎病是一种土传性真菌病害，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf. sp.cubense,Foc)[7-8].Foc主要包括Foc1、Foc2、FocTR4和FocSTR4等类型，其中FocTR4的致病力和侵染力最强[9-10].Foc在土壤中存活时间长，难以防控和根治；同时，香蕉枯萎病的潜伏期较长，且Foc在香蕉整个生长期均可致病[11-12]，这无疑增加了该病的防治难度.近年来，化学、生物和农业防治手段对抑制香蕉枯萎病的发生均取得了一定效果，但尚未形成完全有效的防控方法[13-14].抗病品种的选育是防治枯萎病最根本、最有效的途径[15].目前，香蕉品种的选育方法主要有芽变、组培苗突变体、毒素筛选，常规杂交和基因工程等[16].然而，栽培香蕉多为三倍体，高度不育以及传统育种方法周期长、效率低等问题，导致香蕉品种更新换代速度较慢[17].

香蕉抗病种质的筛选经过组培扩繁、病菌接种试验或田间种植试验等过程，这种筛选方法不仅需要试验人员掌握香蕉组织培养技术，还需消耗大量的人力、物力和财力，同时抗病种质的选出率较低.因此，建立一种简单、快速、低成本的香蕉种质抗枯萎病评价方法意义重大.左存武等[18]研究发现，抗枯萎病香蕉品种根系分泌物有机成分可以抑制FocTR4孢子萌发和菌丝生长，高抗品种甚至对孢子有致死作用.本研究在参照文献[18]的基础上简化根系提取物的制备程序，研究了不同枯萎病抗性的香蕉种质根系水粗提物对FocTR4菌落生长和孢子萌发的影响，以期为评价香蕉种质对枯萎病的抗性提供一种简单、快速的方法.

1 材料与方法

1.1 材料

FocTR4菌株、三明野生蕉以及感病品种‘天宝蕉’和‘福州粉蕉一号’由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供.高抗枯萎病品种‘中蕉九号’和‘中蕉四号’由广东省农业科学院果树研究所提供.所用香蕉材料均为四叶一心、生长均匀的无病幼苗.

1.2 根系水粗提物的提取及培养基制备

取香蕉根系，用自来水冲洗干净后用滤纸吸干表面水分.称取根系20 g，加入50 mL无菌水后置于榨汁机中打磨成匀浆.用4层纱布过滤后收集滤液，5 000 r·min-1离心5 min后取上清，使用MILLEX公司生产的0.22 μm过滤头过滤除菌，滤液加无菌水定容至100 mL，即获得浓度为200 g·L-1根系水粗提物.将根系水粗提物与50～60 ℃的灭菌PDA培养基等体积混匀后倒入直径为8.5 cm的培养皿中，制成含有100 g·L-1根系水粗提物的PDA培养基.以加入等体积无菌水的PDA培养基作为对照.

1.3 FocTR4接种及菌落直径测定

将带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记的FocTR4菌丝接种于PDA培养基中央，于28 ℃生化培养箱中倒置培养7 d.用灭菌的内径为5 mm黄色枪头在菌落边缘切取菌饼，将菌饼反贴于含有100 g·L-1根系水粗提物的PDA培养基中央，于28 ℃生化培养箱中倒置培养.每组处理重复3次.

接种后每天测量菌落直径，直至所有菌落直径达到培养皿直径的2/3[19].参照庄雪峰等[19]的方法计算抑制率.计算公式：抑制率/%=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100.采用Excel和SPSS软件统计数据和分析显著性.

1.4 FocTR4孢子悬浮液制备及孢子萌发情况观察

参照程春振等[20]的方法收集FocTR4孢子，用PDB培养基重悬孢子并稀释至浓度为4×105个·mL-1.将现配的孢子悬浮液分别与三明野生蕉、‘天宝蕉’、‘福州粉蕉一号’、‘中蕉九号’和‘中蕉四号’根系水粗提物等体积混匀，使各根系水粗提物和孢子的终浓度分别为100 g·L-1和2×105个·mL-1.28 ℃、200 r·min-1的摇床中培养48 h，各取1 mL菌液，参照Li et al[21]的方法在激光共聚焦显微镜下观察FocTR4孢子萌发情况.

1.5 香蕉根系含水量测定

为进一步验证不同品种香蕉根系水粗提物对FocTR4抑制效果的差异是否与根系含水量有关，对其含水量进行测定.分别将5种香蕉种质根系冲洗干净，用滤纸吸干表面水分后称其鲜重；然后将根系放入65 ℃烘箱内烘干至恒重，称量干重，并计算含水率.计算公式：含水量/%=(鲜重-干重)/鲜重×100.每种种质至少重复3次.采用Excel和SPSS软件分析香蕉根系含水量与根系水粗提物对FocTR4抑制率的相关性.

2 结果与分析

2.1 香蕉根系水粗提物对FocTR4菌落生长的影响

从表1可以看出，FocTR4的生长直径表现为对照>‘天宝蕉’>‘福州粉蕉一号’>三明野生蕉>‘中蕉九号’≈‘中蕉四号’.FocTR4在含有‘中蕉九号’、‘中蕉四号’、三明野生蕉、‘福州粉蕉一号’根系水粗提物的培养基上培养1～6 d的菌落直径均极显著小于对照；在含有‘天宝蕉’根系水粗提物的培养基上，菌落直径仅在第1、2、4天极显著小于对照.

表1 不同香蕉种质根系水粗提物对FocTR4菌落生长的影响1)Table 1 Influences of crude extracts of different banana root water on the growth of FocTR4 colony

1)下划线表示菌落直径超过培养皿直径的1/2；加粗表示菌落直径超过培养皿直径的2/3.同行数据后附不同大、小写字母者分别表示在0.01、0.05水平上差异极显著，附相同大、小写字母者分别表示在0.01、0.05水平上差异不显著.

培养至第6天，所有培养皿中的菌落直径均大于培养皿直径的2/3(表1).其中，FocTR4在含‘中蕉九号’、‘中蕉四号’和三明野生蕉根系水粗提物培养基上的直径达到1/2和2/3的时间均比对照(4和5 d)推迟1 d；在含‘福州粉蕉一号’根系水粗提物培养基上的直径达到1/2的时间与对照相同，达到2/3的时间比对照推迟1 d；在含‘天宝蕉’根系水粗提物培养基上的直径达到1/2和2/3的时间与对照相同.

图1 不同香蕉种质根系水粗提物对FocTR4抑制率的比较Fig.1 Comparisons on the inhibition ratio of crude extracts of different banana root water on FocTR4

5种香蕉根系水粗提物对FocTR4的抑制率表现为‘中蕉九号’≈‘中蕉四号’>三明野生蕉>‘福州粉蕉一号’>‘天宝蕉’(图1).

2.2 香蕉根系水粗提物对FocTR4孢子萌发的影响

培养48 h后，对照组FocTR4孢子萌发较好，菌丝多且荧光较强，菌丝分支也多(图2A)；‘中蕉九号’处理组FocTR4荧光较弱，菌丝数目及菌丝分支少(图2B)；‘中蕉四号’处理组仍可观察到大量未萌发孢子，菌丝少且短，荧光较弱(图2C)；三明野生蕉处理组FocTR4菌丝少且短，菌丝分支少，少数孢子未萌发，荧光较强(图2D)；‘福州粉蕉一号’处理组FocTR4菌丝较长且分支多，未萌发孢子较少，荧光较强(图2E)；‘天宝蕉’处理组FocTR4菌丝较多且缠绕，菌丝分支也多，未萌发孢子较少，荧光较强(图2F).

A.无菌水;B.‘中蕉九号’;C.‘中蕉四号’;D.三明野生蕉;E.‘福州粉蕉一号’;F.‘天宝蕉’.图2 FocTR4孢子在含有不同根系水粗提物的PDB培养基中的萌发情况Fig.2 Germination of FocTR4 spores in PDB medium containing different crude extracts of root water

2.3 香蕉根系含水量与根系水粗提物抑菌率相关性分析

测定结果表明：‘天宝蕉’根系含水量最高，达95.27%；‘中蕉四号’(94.35%)、‘中蕉九号’(94.18%)和三明野生蕉(92.95%)次之；‘福州粉蕉一号’根系含水量最低，约88.05%.通过分析根系含水量与培养1～6 d根系水粗提物对FocTR4的抑制率发现，香蕉根系含水量与根系水粗提物抑菌率无显著相关性(表2).

表2 香蕉根系含水量与根系水粗提物对FocTR4抑制率相关性分析Table 2 Correlation analysis on water content of banana root and its inhibition ratio to FocTR4

3 讨论

3.1 香蕉根系水粗提物对FocTR4的抑制效果与香蕉种质抗性相关

‘中蕉九号’是广东农业科学院通过‘金手指’和‘SH-3142’杂交获得的不感病品种[11]；‘中蕉四号’对枯萎病表现出较强抗性[22]；野生蕉的抗病、抗寒能力优于香蕉栽培品种，程春振等[20]发现枯萎病菌侵染三明野生蕉维管束的速率慢于对‘天宝蕉’的侵染；粉蕉和‘天宝蕉’种植面积较大，但对枯萎病敏感[20,23].本研究发现，供试香蕉种质根系水粗提物对FocTR4菌丝生长和孢子萌发的抑制效果表现为‘中蕉九号’≈‘中蕉四号’>三明野生蕉>‘福州粉蕉一号’>‘天宝蕉’，与不同香蕉种质对枯萎病的抗性呈正相关.

3.2 研究根系水粗提物对病原菌生长和孢子萌发的影响可作为香蕉种质对枯萎病抗性的初评方法

抗病性评估是香蕉抗病种质筛选的主要方法，其中，田间种植评估和苗期抗性评估最为常用[24].通过田间种植评估筛选抗病苗最为可靠，但耗时长，鉴定成本高，且土壤中的病原菌分布不均，会使测定结果出现一定误差[25].伤根灌注法是苗期抗性评价的主要方法，虽接种效果相对稳定，但受季节及环境条件影响大，需要严格控制试验条件[26].为了建立快速、准确的香蕉对枯萎病抗性的评价方法以及减少环境因素和其他条件的影响，左存武等[27]改良了浸根法，但仍需要严格控制条件且时间较长.过氧化氢酶(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase, PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammo-nialyase, PAL)、β-1,3-葡聚糖酶和外切几丁质酶的活性以及木质素含量常被用作香蕉种质抗性评价的辅助指标[28-30]，但这些指标受环境影响较大.通过研究根系分泌物对枯萎病菌孢子萌发、菌丝生长的影响也可初步评价香蕉种质对枯萎病的抗性[18]；但是，根系分泌物的主要作用是抵御病原菌入侵，不能充分反映病原菌侵入香蕉根系后的生长情况.考虑到FocTR4可以侵染几乎所有的香蕉种质[11,31]，认为根系内含物对FocTR4的抑制效果更能体现香蕉种质的抗病情况.

本研究发现，香蕉抗枯萎病品种的根系水粗提物能抑制枯萎病菌的孢子萌发和菌丝生长，与左存武等[18]的研究结果相符.因此，通过研究香蕉根系水粗提物对FocTR4菌丝生长和孢子萌发的抑制效果可以初步评价香蕉品种的抗病性.该评价方法具有3个优点：(1)方法简单，无需对种质进行组培扩繁，且仅需取少量根系即可制备根系水粗提物；(2)耗时较短，研究根系水粗提物对香蕉枯萎病菌菌丝生长的影响可在5～6 d内完成，研究其对病原菌孢子萌发的影响仅需2 d；(3)根据病原菌菌丝生长及孢子萌发情况可直观判断香蕉种质对枯萎病的抗性，且根系水粗提物对病原菌菌丝生长的影响和对孢子萌发的影响可以相互佐证，提高评价结果的可信度.