microRNAs在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用

姚晓楠，王良雨，彭丽俊，于丹阳，周占宇

0引言

过去30a里，全球糖尿病患病率几乎翻了一番，2017年约有4.25亿人患有糖尿病[1]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病远期并发症中最常见的一种，可导致糖尿病性黄斑水肿的发生和视力的丧失[2]。视网膜血管对高血糖最早的反应是血管扩张和血流改变，这种变化引起视网膜代谢自动调节，增加糖尿病患者的视网膜代谢[3]。随着疾病的发展，毛细血管无灌注区的产生可导致新生血管开始生长，发展成为增殖性DR。而DR的这些病理改变是通过缺氧、慢性炎症、氧化应激、糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)形成、肾素-血管紧张素通路、生长因子、脂质氧化及其产物等多种机制激活的[4-6]。多种细胞因子可以激活DR病理方面的信号通路，包括视网膜新生血管形成和黄斑水肿，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)会诱导血管的通透性增加，促进新生血管的生成，在DR的发病机制中起着重要作用[5]。磷脂酶Cγ、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、Ca2+、细胞外信号调节蛋白激酶、蛋白激酶B等通路的激活参与介导VEGF的多种功能，包括生存、增殖、迁移、增加血管渗透性和基因表达。

1 DR发病机制中microRNAs的作用

microRNAs是一类非编码小RNA，通过与靶基因mRNA的3’-UTR(3’-untranslated regions)相互作用，抑制mRNA的翻译或诱导其降解，在转录后水平调节靶基因的表达，是调控基因表达的关键参数[7-8]。microRNAs不仅控制靶mRNAs的翻译和稳定性，而且还参与许多细胞的活动[9]。一些研究表明，microRNAs水平的改变在视网膜血管功能改变和血管生成相关疾病的病理变化中具有重要作用[10](表1)。因此，microRNAs可以作为干预视网膜新生血管形成的合适分子靶点[11-13]。新生血管形成是DR发病机制中一个重要的病理改变，所以microRNAs在DR的发生中也有一定的作用。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞对正常视力起着至关重要的作用。VEGF升高时可以促进RPE细胞增殖[14]，使血管通透性增加，导致视网膜渗出、出血、水肿[15]。有些microRNAs可以在生理和病理状态下影响RPE，miR-328基因在RPE细胞中表达，应用维甲酸处理RPE细胞可能导致miR-328表达增加，同时miR-328也可以通过直接下调人类配对盒基因6(Pax6)引起RPE细胞增殖增加[16]。miR-204/211可以调控RPE细胞的分化[17]。VEGF水平升高可诱导miR-17、miR-20a、miR-18a、miR-31等在糖尿病患者视网膜细胞中表达水平上调，进而可能介导VEGF在DR中的不良作用。近年来的研究表明，miR-106a、miR-146、miR-181、miR-199a、miR-214、miR-424、miR-451在缺血视网膜细胞中显著升高，而miR-31、miR-150、miR-184水平下降，眼内注射miR-31、miR-150和miR-184能够显著减少视网膜新生血管形成[18]。以下将通过文献回顾，探讨不同microRNAs在DR新生血管形成机制中的作用。

表1 不同类型microRNAs在新生血管形成中的作用机制

microRNAs作用机制miR-146降低纤维连接蛋白的表达;抑制核转录因子-κB(NF-κB)的激活通路。microRNA-34a通过抑制富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(LGR4)和c-Met基因表达以抑制视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的生长、迁移和增殖。microRNA-155通过抑制多肌醇-5-磷酸酶(SHIP1)增强PI3K-Akt信号通路引起视网膜新生血管形成。microRNA-182通过抑制肝细胞生长因子抑制RPE细胞的增殖和迁移。microRNA-126通过下调有丝分裂原激活蛋白激酶通路中的p38,抑制VEGF、胰岛素生长因子-2(IGF-2)和低氧诱导因子-1α(HIF-1α);下调胰岛素受体底物-1(IRS-1)的表达抑制PI3K/Akt通路和血管生成;调控视网膜血管细胞黏附蛋白-1(VCAM-1)和Bcl-2的表达。microRNA-410通过下调VEGF基因表达抑制视网膜新生血管形成。microRNA-133b下调Rho相关蛋白激酶信号通路抑制RPE细胞增殖,并促进其凋亡。microRNA-29通过靶向Akt2参与RPE细胞中转化生长因子-β1(TGF-β1)介导上皮间充质转化(EMT)的过程。microRNA-124影响参与RPE细胞表型改变的靶基因。microRNA-132通过激活肾素血管紧张素系统(RAS)途径诱导新生血管形成。microRNA-152与肾素原受体(PRR)mRNA相互作用共同调节视网膜内皮细胞中VEGF和TGF-β1的表达。microRNA-184通过抑制Wnt信号通路,防止缺血诱导的视网膜新生血管形成。microRNA-218通过抑制环状诱导受体1(Robo1)的表达,作为氧诱导视网膜新生血管的调节剂。microRNA-15a/16抑制视网膜内皮细胞中的TGF-β3、SMAD2/3磷酸化和VEGF水平,增加紧密连接蛋白和闭锁蛋白(occlu-din)的水平。microRNA-200b/c抑制视网膜细胞的增殖和迁移;降低视网膜细胞VEGF基因表达、血管生成和葡萄糖诱导的细胞通透性;下调抗氧化物1(Oxr1)和TGF-β1的水平。

1.1 microRNA-146miR-146家族有miR-146a和miR-146b两种。miR-146a可以降低纤维连接蛋白的表达，减轻微血管纤维化，Feng等[19]研究发现，miR-146a在糖尿病大鼠眼内表达降低。另外，核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)可以促进凋亡小体的表达，引起视网膜血管周细胞凋亡和无细胞毛细血管的增加，导致视网膜局部微循环障碍[20]，而miR-146可以抑制NF-κB的激活通路，使其成为DR的治疗靶点[21]。

1.2 microRNA-34miR-34a是多种肿瘤的抑癌因子，可影响沉默信息调节因子-1、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、c-Met (cellular-mesenchymal to epithelial transition factor)基因、多种细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶等靶基因的表达[22]。miR-34a通过抑制富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(leucine rich repeat containing G protein coupled receptor 4，LGR4)和c-Met基因表达来抑制RPE细胞的生长、迁移和增殖。c-Met基因在DR患者RPE细胞中高表达，参与RPE细胞的增殖和迁移，因此抑制c-Met基因可作为控制RPE参与DR的基因靶点[23]。LGR4是miR-34a的另一个直接靶基因，可调控急性视网膜色素上皮-19(acute retinal pegment epitheliitis-19，ARPE-19)细胞的增殖、迁移和黏附。miR-34a表达增加可以抑制LGR4表达和ARPE-19细胞的增殖迁移，因此miR-34a和LGR4可能介导细胞周期进程的控制。综上，miR-34a可能在视网膜疾病的治疗中具有重要的临床疗效[22]。

1.3 microRNA-155miR-155可在RPE细胞中表达，缺氧和VEGF的激活可以诱导miR-155的表达。miR-155能提高缺氧诱导因子-1/2(hypoxia inducible factor-1/2，HIF-1/2)的活性，后者可促进VEGF的表达。在动物模型中抑制miR-155可以下调含有多肌醇-5-磷酸酶(SHIP1)和PI3K/pAkt信号通路的SH2结构域，从而减少视网膜新生血管的形成、增殖和迁移；而miR-155过表达后3’-UTR抑制了SHIP1，使PI3K/pAkt信号通路增强。因此，PI3K-pAkt信号通路直接参与miR-155表达和SHIP1水平的调控[24-25]。

1.4 microRNA-182miR-182对视网膜的发育和功能可能有着重要的调控作用，是维持成人锥体光感受器外段和视觉功能所必需的。肝细胞生长因子具有诱导RPE细胞增殖和迁移的作用，miR-182可以通过靶向c-Met途径抑制肝细胞生长因子[26]。在DR患者的视网膜中miR-182的表达显著降低，导致c-Met和PI3K/Akt信号通路上调，提示miR-182表达下调可能参与DR的发生[27]。因此，上调miR-182表达可能对改善增殖性视网膜病变并发症有治疗作用[28]。

1.5 microRNA-126miR-126与血管生成密切相关，是PDR中筛选视网膜内皮损伤或血管并发症的生物标志物之一[29-30]。miR-126可以通过下调有丝分裂原激活蛋白激酶通路中的p38，直接抑制VEGF高水平和胰岛素生长因子-2(insulin growth factor-2，IGF-2)，并间接抑制低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)，从而导致视网膜新生血管减少[31-32]。HIF-1α的大量表达可以导致VEGF水平的上调，反之亦然[33]。VEGF和HIF-1α在DR和其他视网膜疾病的进展中有重要作用，包括年龄相关性黄斑变性和视网膜缺氧反应，这种交叉干扰可能有显著的治疗意义[31]。另外，miR-126可能通过悬浮细胞周期发育抑制VEGF和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表达来抑制新生血管形成[34]，但在缺氧条件下，miR-126表达下调。miR-126的表达增加可以抑制高血糖诱导的内皮细胞的迁移和发育，这可能是由于VEGF/PI3K/AKT信号通路中VEGF被阻断所致。有研究表明，miR-126对PI3K/Akt通路和血管生成的抑制作用是由于该miRNA下调胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)的表达。基于目前的研究，miR-126可以直接或间接调控视网膜血管细胞黏附蛋白-1(vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1)和Bcl-2的表达，这二者是视网膜病变中BRB破坏过程中必不可少的细胞因子[35]。因此，miR-126在视网膜中起保护作用，保护BRB完整性和神经元存活，在DR的发病机制中发挥重要的作用。

1.6 microRNA-410miR-410是视网膜新生血管形成的调控因子，可诱导多种细胞中VEGF基因表达下调。一些研究人员已经证明，含有miR-410的滴眼液可以成功抑制DR模型眼中新生血管的形成[19]。miR-410直接调控RPE特异性因子基因，抑制miR-410的表达可诱导这些因子过表达。总的来说，miR-410的抑制作用可以融入细胞分化中，利用其给药可以成为治疗DR的一种新的细胞治疗技术[36-37]。

1.7 microRNA-133b目前有证据表明，miR-133b可通过下调Rho相关蛋白激酶信号通路抑制DR模型中RPE细胞增殖，并促进其凋亡[38]。

1.8 microRNA-29microRNA-29可能通过靶向Akt2参与RPE细胞中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)介导上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的过程。增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)被认为是由RPE细胞的EMT驱动的纤维化过程，引起视网膜牵拉并导致手术失败。一些研究表明，NF-κB途径激活可抑制microRNA-29，导致RPE细胞中MMP-2蛋白表达上调引起新生血管生成。因此，这些发现可能会为未来预防或治疗PVR的发生提供新的临床治疗策略[39]。

1.9 microRNA-124miR-124参与靶基因的表达，这些靶基因参与DR中RPE细胞向其他表型RPE细胞的转分化。miR-124在EMT进展过程中表达水平下调。有文献报道，miR-124的外源性补充将是预防或治疗PVR的一种有价值的治疗方法[40]。

1.10 microRNA-132miR-132可通过对新生血管刺激因子的作用，在血管过度增殖、血管瘤和肿瘤血管发生中发挥重要作用，对新生血管形成过程中起调节作用[41]。肾素血管紧张素系统(renin angiotensin systems，RAS)通路在包括VEGF在内的多种细胞因子的下游发挥作用，活跃于发育中的血管和病理血管网络。miR-132类似于一个“血管生成开关”，通过RAS途径激活诱导新生血管形成，而抗miR-132药物的应用通过维持血管处于静息状态来抑制新生血管形成[42]。以miR-132作为基因靶点可能对治疗多种眼部新生血管性疾病和预防视力丧失有帮助[43]。

1.11 microRNA-152在高血糖的状态下，miR-152可以直接与肾素原受体(pro-renin receptor，PRR)mRNA相互作用共同调节人类视网膜内皮细胞中VEGF和TGF-β1的表达。TGF-β不仅可以促进内皮细胞的增生、黏附和细胞外基质沉积[44-45]，还可以通过增加纤维连接蛋白合成导致血管纤维化[46]。PRR和RAS在视网膜内皮细胞及其他眼组织血压的生理和病理生理调节中具有重要作用[47]。目前证据表明，RAS抑制剂在DR中可能会产生有益的作用[48]。

1.12 microRNA-184miR-184富含于眼病患者的玻璃体中[49]，能抑制视网膜Wnt信号通路。Wnt信号是一种胞内信号通路，由Wnt配体、共受体和细胞内信号级联组成，调控包括细胞分化和血管生成在内的多种细胞过程。有报道称，视网膜Wnt信号通路异常激活是DR模型中视网膜炎症和视网膜新生血管形成的主要致病机制[50-52]。缺血状态时，miR-184表达减少导致Wnt信号通路异常活化，诱导视网膜新生血管形成。因此，在DR中通过Wnt信号通路预防炎症反应和新生血管形成，可能成为一种新的治疗方式[53]。

1.13 microRNA-218miR-218由slit基因内含子编码，该内含子抑制环状诱导受体1(roundabout guidance receptor1，Robo1)以及参与硫酸肝素生物合成途径的多个因子的表达。miR-218-slit基因-Robo调控网络是视网膜正常血管化的关键，而miR-218基因表达的下调导致信号轴异常调控，内皮细胞异常迁移，视网膜血管卷积减少[54]。因此，miR-218通过与Robo1的3’-UTR结合使Robo1表达下调，可以作为缺氧诱导视网膜新生血管的调节剂。研究表明，Robo1在内皮细胞迁移和新生血管形成中具有积极作用，降低Robo1可明显抑制内皮细胞迁移。所以，下调Robo1可显著抑制DR视网膜新生血管形成[55]。

1.14 microRNA-15a/16Ye等[56]证实，在高血糖状态时，miR-15a/16可抑制视网膜内皮细胞中的TGF-β3、Smad2/3磷酸化和VEGF水平，增加紧密连接蛋白和闭锁蛋白(occludin)的水平。在体外诱导的高血糖条件下，miR-15a/16过表达可抑制VEGF，引起视网膜内皮细胞通透性降低。因此，miR-15a/16可能是治疗DR的潜在分子靶点[56]。

1.15 microRNA-200b/cmiR-200b/c通过下调血管抑制蛋白-2(vasohibin-2，VASH-2)表达抑制视网膜细胞的增殖和迁移，可以对高糖引起的人视网膜微血管内皮细胞功能障碍发挥保护作用[57]。近年研究表明，VASH-2可在骨髓来源的单核细胞中特异性表达，在血管生成中发挥重要作用。一些研究已经阐述了被DR损伤的内皮细胞纤维血管膜中血管生成与VASH2之间的关系，是DR潜在治疗靶点之一。因此，miR -200b/c也可能成为治疗视网膜新生血管形成的一种新方法。另一方面，miR-200b可降低糖尿病大鼠视网膜细胞VEGF基因表达、血管生成和葡萄糖诱导的细胞通透性。miR 200b还可下调抗氧化物1(oxidation resistance 1，Oxr1)和TGF-β1的水平，具有保护视网膜细胞凋亡的作用[58]。

2总结与展望

综上所述，不同microRNA在视网膜新生血管形成中具有不同的作用，可对DR发生和发展过程发挥重要的作用，在DR发展过程的任何阶段都应研究不同类型miRNA水平的变化，根据不同病理条件下microRNA表达的变化选择新颖、高效、适合的治疗方法。