Notch信号通路在间充质干细胞分化成唾液腺腺泡细胞中的作用

2019-09-06 10:05黄邓高王伟锋符先先
实用药物与临床 2019年8期
关键词:腺泡唾液腺下层

程 钢,黄邓高,梁 颖,王伟锋,符先先,袁 峰

0 引言

放射性唾液腺损伤是头颈部癌症放射治疗后常见的不良反应[1-2],鼻咽癌是华南地区高发肿瘤,放射治疗是鼻咽癌的主要根治性手段,97.9%的鼻咽癌患者放疗后会发生放射性唾液腺损伤,临床表现为口干、吞咽和发音困难、味觉丧失、念珠菌感染、龋齿等[3-5]。唾液腺由一些腺泡细胞组成,对放射线敏感,放射性唾液腺损伤主要是损伤腺泡细胞[6-7]。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有向不同胚层细胞增殖和分化的能力,有研究报道其已诱导出神经细胞、脂肪细胞、骨细胞等[8-9],向唾液腺腺泡细胞的分化也有动物细胞实验获得了成功,为临床唾液腺腺泡细胞损伤的修复开辟了一个新的治疗方法[10]。本研究观察了Notch信号通路在骨髓MSCs分化成唾液腺腺泡细胞过程中的作用,为MSCs分化成腺泡细胞的调控提供更多的靶分子。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 40只1周龄健康雄性SD大鼠和40只6~8周龄健康雄性SD大鼠购自海南医学院动物实验中心,DMEM/F12 培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司,Notch、α-淀粉酶抗体购自美国Cell Signal公司,FITC标记二抗购自美国RD公司,免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物科技技术有限公司,分层培养Transwell小室购自美国Corning 公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司,流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2 骨髓MSCs的分离和鉴定 用颈椎脱臼法处死6~8周健康SD大鼠,无菌分离股骨及胫骨,剪断两端,注射器吸取DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔,加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素,37 ℃和5% CO2条件下培养24 h,24 h后去除悬浮细胞,保留贴壁细胞。MSCs的鉴定采用验证其向脂肪细胞分化的潜能,贴壁细胞加入诱导剂继续培养2周,油红-O染色观察脂肪细胞分化情况。

1.3 唾液腺腺泡细胞的分离和鉴定 用颈椎脱臼法处死1周龄健康SD大鼠,75%酒精浸泡5 min,摘除双侧颌下腺,去除腺体周围被膜、脂肪和结缔组织,将腺体剪成1 mm3左右组织块,0.125%Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴消化40 min,吹打组织制备细胞悬液,培养于腺细胞专用培养基,利用差速黏附法纯化腺泡细胞,纯化的细胞爬片后,4%多聚甲醛固定,免疫组织化学染色,α-淀粉酶染色阳性为腺泡细胞。

1.4 骨髓MSCs的诱导分化 Transwell小室分上下2层,中间有生物膜相隔,上下层细胞不会接触,但细胞分泌的因子可相互影响。实验分为诱导分化组和对照组,诱导分化组:上层MSCs、下层腺泡细胞,MSCs∶腺泡细胞=1∶4,对照组:上下层均是MSCs,1×104/孔。培养2周后,收集细胞上层MSCs细胞,流式细胞仪检测淀粉酶抗体染色阳性的MSCs向腺泡细胞分化情况。

1.5 Notch蛋白的检测 实验分为4组,每组各10只。A组:上下层均是MSCs;B组:上层MSCs和下层腺泡细胞共培养;C组:上层MSCs和下层腺泡细胞共培养,加入Notch激活剂Jagged1;D组:上层MSCs和下层腺泡细胞共培养,加入Notch抑制剂DAPT。培养2周后,收获上层MSCs,Western blot测定Notch蛋白表达情况,SDS-PAGE凝胶分离蛋白,电转膜后,封闭液孵育膜1 h,加入Notch1抗体过夜孵育,加入二抗孵育2 h,化学发光法检测Notch蛋白表达。流式细胞仪检测不同分组上层MSCs向腺泡细胞分化情况。

1.6 腺泡细胞的流式细胞仪检测 制备的单细胞悬液,调整细胞密度为1×105个/ml,取200 μl加入淀粉酶抗体一抗和FITC标记二抗,室温孵育1 h,流式细胞仪检测抗体标记阳性细胞所占的比例,简述如下:前向散射光和侧向散射光做门R1,去除细胞碎片,关联R1,FL1通道设置R2,检测FITC阳性细胞的比例。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0软件,两组独立样本均数比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,组间比较采用LSD检验,计数资料比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Transwell小室共培养诱导了MSCs向腺泡细胞分化 分离的骨髓MSCs贴壁生长,均一的长梭形,诱导2周后油红-O染色,胞浆内可见红色脂滴。制备的唾液腺腺泡细胞差速黏附法去除成纤维细胞,细胞铺满培养皿6~8 d传代1次,第3代时细胞爬片,α-淀粉酶免疫组化染色,见细胞α-淀粉酶阳性。Transwell小室混合培养后,流式细胞仪检测小室上层MSCs中α-淀粉酶阳性的腺泡细胞比例,结果显示,诱导分化组α-淀粉酶阳性细胞的比例为52.34%±8.26%,对照组未检测到阳性细胞。见图1。

图1 对照组(A)、诱导分化组(B)腺泡细胞的流式细胞仪检测

2.2 Notch蛋白在MSCs向腺泡细胞分化中的作用 从图2可见,B组Notch蛋白表达量显著高于A组。C组Notch蛋白表达量显著高于B组。D组Notch蛋白表达量显著高于B组。从表1可见,流式细胞仪检测A、B、C、D组上层MSCs中α-淀粉酶染色阳性腺泡细胞的比例分别为0、52.34%±8.26%、66.72%±9.43%、38.55%±6.81%,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 Notch信号的Western blot检测

注:A.上下层均为MSCs;B.上层MSCs和下层腺泡细胞;C.上层MSCs和下层腺泡细胞,加入Jagged1;D.上层MSCs和下层腺泡细胞,加入DAPT

表1 不同分组MSCs向腺泡细胞分化的比较

注:*与A组比较,P<0.01;#与B组比较,P<0.05;△与C组比较,P<0.01

3 讨论

放射性唾液腺损伤的机制目前尚不明确,因此,仍然缺少特效的预防和治疗方法[11-12],临床上的治疗多是针对症状的姑息性治疗,例如,使用唾液替代物或唾液分泌刺激胆碱能剂。代用品几乎不可能复制天然唾液的所有功能,胆碱能药物虽然可以刺激未受损腺体的天然唾液分泌,但是长期服用后的出汗、过度流泪和胃肠道疼痛等不良反应,给患者的生活带来新的不利影响[13-15]。

MSCs最大的特点是在合适的条件可分化为各种来源的细胞,其作为种子细胞越来越多地应用于医学领域[16-17]。祁荆荆等[18]在颌下腺注射间充质干细胞治疗干燥综合征,发现了修复受损腺泡细胞的作用。笔者前期动物实验研究显示,骨髓间充质干细胞可以发挥治疗小鼠放射性唾液腺损伤作用[19]。本研究在此基础上也构建了诱导MSCs分化成唾液腺腺泡细胞的3D细胞培养系统,结果显示,诱导分化2周后,52.34%±8.26%的MSCs分化为α-淀粉酶阳性细胞的腺泡细胞,与梁亮等[20]的转化效率相接近。研究MSCs向腺泡细胞分化的机制,对于提高转化效率具有积极的意义[21]。王继荣等[22]研究显示,Notch信号在骨髓MSCs的分化过程中发挥着重要的作用,Notch信号通路广泛存在于动物和人体,进化上高度保守,参与胚胎、细胞发育。维持造血干细胞的自我更新,调节血管生成,其主要的生理功能体现在调节细胞分化与组织发育上[23-24]。Notch信号通路对MSCs的分化起重要的调节作用,Notch通路可促进MSCs向成骨细胞分化,Notch通路的激活是启动软骨细胞分化的关键[25-26]。图1显示,B组Notch蛋白表达量显著高于A组,说明上层MSCs和下层腺泡细胞共培养较单独的MSCs 培养Notch蛋白表达量升高,存在Notch通路的激活。C组Notch蛋白表达量显著高于B组,说明加入Notch信号激活剂后,蛋白的表达显著升高。D组Notch蛋白表达量显著高于B组,说明加入Notch信号抑制剂后,蛋白的表达显著减低。流式细胞仪的检测结果也显示,Notch通路的激活可能在诱导上层MSCs向腺泡细胞分化过程中发挥了作用,随后加入Notch信号激活剂或抑制剂后,MSCs向腺泡细胞分化的比例也会相应增强或减弱。提示Notch通路的激活在诱导MSCs向腺泡细胞分化的过程中发挥了重要作用,调节Notch通路有可能调节MSCs转化为唾液腺腺泡细胞的效率。

综上所述,MSCs向唾液腺腺泡细胞分化过程中Notch通路激活,激活或抑制Notch通路可以增强或减弱MSCs转化为唾液腺腺泡细胞的效率。但是本研究仅仅是体外实验阶段,体内注入MSCs后,能否到达唾液腺分化为腺泡细胞,还有待进一步实验来证实。

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