Notch信号通路在间充质干细胞分化成唾液腺腺泡细胞中的作用

程 钢，黄邓高，梁 颖，王伟锋，符先先，袁 峰

0 引言

放射性唾液腺损伤是头颈部癌症放射治疗后常见的不良反应[1-2]，鼻咽癌是华南地区高发肿瘤，放射治疗是鼻咽癌的主要根治性手段，97.9%的鼻咽癌患者放疗后会发生放射性唾液腺损伤，临床表现为口干、吞咽和发音困难、味觉丧失、念珠菌感染、龋齿等[3-5]。唾液腺由一些腺泡细胞组成，对放射线敏感，放射性唾液腺损伤主要是损伤腺泡细胞[6-7]。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有向不同胚层细胞增殖和分化的能力，有研究报道其已诱导出神经细胞、脂肪细胞、骨细胞等[8-9]，向唾液腺腺泡细胞的分化也有动物细胞实验获得了成功，为临床唾液腺腺泡细胞损伤的修复开辟了一个新的治疗方法[10]。本研究观察了Notch信号通路在骨髓MSCs分化成唾液腺腺泡细胞过程中的作用，为MSCs分化成腺泡细胞的调控提供更多的靶分子。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 40只1周龄健康雄性SD大鼠和40只6～8周龄健康雄性SD大鼠购自海南医学院动物实验中心，DMEM/F12 培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司，Notch、α-淀粉酶抗体购自美国Cell Signal公司，FITC标记二抗购自美国RD公司，免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物科技技术有限公司，分层培养Transwell小室购自美国Corning 公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2 骨髓MSCs的分离和鉴定 用颈椎脱臼法处死6～8周健康SD大鼠，无菌分离股骨及胫骨，剪断两端，注射器吸取DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，37 ℃和5% CO2条件下培养24 h，24 h后去除悬浮细胞，保留贴壁细胞。MSCs的鉴定采用验证其向脂肪细胞分化的潜能，贴壁细胞加入诱导剂继续培养2周，油红-O染色观察脂肪细胞分化情况。

1.3 唾液腺腺泡细胞的分离和鉴定 用颈椎脱臼法处死1周龄健康SD大鼠，75%酒精浸泡5 min，摘除双侧颌下腺，去除腺体周围被膜、脂肪和结缔组织，将腺体剪成1 mm3左右组织块，0.125%Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴消化40 min，吹打组织制备细胞悬液，培养于腺细胞专用培养基，利用差速黏附法纯化腺泡细胞，纯化的细胞爬片后，4%多聚甲醛固定，免疫组织化学染色，α-淀粉酶染色阳性为腺泡细胞。

1.4 骨髓MSCs的诱导分化 Transwell小室分上下2层，中间有生物膜相隔，上下层细胞不会接触，但细胞分泌的因子可相互影响。实验分为诱导分化组和对照组，诱导分化组：上层MSCs、下层腺泡细胞，MSCs∶腺泡细胞=1∶4，对照组：上下层均是MSCs，1×104/孔。培养2周后，收集细胞上层MSCs细胞，流式细胞仪检测淀粉酶抗体染色阳性的MSCs向腺泡细胞分化情况。

1.5 Notch蛋白的检测 实验分为4组，每组各10只。A组：上下层均是MSCs；B组：上层MSCs和下层腺泡细胞共培养；C组：上层MSCs和下层腺泡细胞共培养，加入Notch激活剂Jagged1；D组：上层MSCs和下层腺泡细胞共培养，加入Notch抑制剂DAPT。培养2周后，收获上层MSCs，Western blot测定Notch蛋白表达情况，SDS-PAGE凝胶分离蛋白，电转膜后，封闭液孵育膜1 h，加入Notch1抗体过夜孵育，加入二抗孵育2 h，化学发光法检测Notch蛋白表达。流式细胞仪检测不同分组上层MSCs向腺泡细胞分化情况。

1.6 腺泡细胞的流式细胞仪检测 制备的单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/ml，取200 μl加入淀粉酶抗体一抗和FITC标记二抗，室温孵育1 h，流式细胞仪检测抗体标记阳性细胞所占的比例，简述如下：前向散射光和侧向散射光做门R1，去除细胞碎片，关联R1，FL1通道设置R2，检测FITC阳性细胞的比例。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0软件，两组独立样本均数比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组间比较采用LSD检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Transwell小室共培养诱导了MSCs向腺泡细胞分化 分离的骨髓MSCs贴壁生长，均一的长梭形，诱导2周后油红-O染色，胞浆内可见红色脂滴。制备的唾液腺腺泡细胞差速黏附法去除成纤维细胞，细胞铺满培养皿6～8 d传代1次，第3代时细胞爬片，α-淀粉酶免疫组化染色，见细胞α-淀粉酶阳性。Transwell小室混合培养后，流式细胞仪检测小室上层MSCs中α-淀粉酶阳性的腺泡细胞比例，结果显示，诱导分化组α-淀粉酶阳性细胞的比例为52.34%±8.26%，对照组未检测到阳性细胞。见图1。

图1 对照组(A)、诱导分化组(B)腺泡细胞的流式细胞仪检测

2.2 Notch蛋白在MSCs向腺泡细胞分化中的作用 从图2可见，B组Notch蛋白表达量显著高于A组。C组Notch蛋白表达量显著高于B组。D组Notch蛋白表达量显著高于B组。从表1可见，流式细胞仪检测A、B、C、D组上层MSCs中α-淀粉酶染色阳性腺泡细胞的比例分别为0、52.34%±8.26%、66.72%±9.43%、38.55%±6.81%，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 Notch信号的Western blot检测

注：A.上下层均为MSCs；B.上层MSCs和下层腺泡细胞；C.上层MSCs和下层腺泡细胞，加入Jagged1；D.上层MSCs和下层腺泡细胞，加入DAPT

表1 不同分组MSCs向腺泡细胞分化的比较

注：*与A组比较，P<0.01；#与B组比较，P<0.05；△与C组比较，P<0.01

3 讨论

放射性唾液腺损伤的机制目前尚不明确，因此，仍然缺少特效的预防和治疗方法[11-12]，临床上的治疗多是针对症状的姑息性治疗，例如，使用唾液替代物或唾液分泌刺激胆碱能剂。代用品几乎不可能复制天然唾液的所有功能，胆碱能药物虽然可以刺激未受损腺体的天然唾液分泌，但是长期服用后的出汗、过度流泪和胃肠道疼痛等不良反应，给患者的生活带来新的不利影响[13-15]。

MSCs最大的特点是在合适的条件可分化为各种来源的细胞，其作为种子细胞越来越多地应用于医学领域[16-17]。祁荆荆等[18]在颌下腺注射间充质干细胞治疗干燥综合征，发现了修复受损腺泡细胞的作用。笔者前期动物实验研究显示，骨髓间充质干细胞可以发挥治疗小鼠放射性唾液腺损伤作用[19]。本研究在此基础上也构建了诱导MSCs分化成唾液腺腺泡细胞的3D细胞培养系统，结果显示，诱导分化2周后，52.34%±8.26%的MSCs分化为α-淀粉酶阳性细胞的腺泡细胞，与梁亮等[20]的转化效率相接近。研究MSCs向腺泡细胞分化的机制，对于提高转化效率具有积极的意义[21]。王继荣等[22]研究显示，Notch信号在骨髓MSCs的分化过程中发挥着重要的作用，Notch信号通路广泛存在于动物和人体，进化上高度保守，参与胚胎、细胞发育。维持造血干细胞的自我更新，调节血管生成，其主要的生理功能体现在调节细胞分化与组织发育上[23-24]。Notch信号通路对MSCs的分化起重要的调节作用，Notch通路可促进MSCs向成骨细胞分化，Notch通路的激活是启动软骨细胞分化的关键[25-26]。图1显示，B组Notch蛋白表达量显著高于A组，说明上层MSCs和下层腺泡细胞共培养较单独的MSCs 培养Notch蛋白表达量升高，存在Notch通路的激活。C组Notch蛋白表达量显著高于B组，说明加入Notch信号激活剂后，蛋白的表达显著升高。D组Notch蛋白表达量显著高于B组，说明加入Notch信号抑制剂后，蛋白的表达显著减低。流式细胞仪的检测结果也显示，Notch通路的激活可能在诱导上层MSCs向腺泡细胞分化过程中发挥了作用，随后加入Notch信号激活剂或抑制剂后，MSCs向腺泡细胞分化的比例也会相应增强或减弱。提示Notch通路的激活在诱导MSCs向腺泡细胞分化的过程中发挥了重要作用，调节Notch通路有可能调节MSCs转化为唾液腺腺泡细胞的效率。

综上所述，MSCs向唾液腺腺泡细胞分化过程中Notch通路激活，激活或抑制Notch通路可以增强或减弱MSCs转化为唾液腺腺泡细胞的效率。但是本研究仅仅是体外实验阶段，体内注入MSCs后，能否到达唾液腺分化为腺泡细胞，还有待进一步实验来证实。