食品中多种水溶性维生素快速检测的方法研究

詹越城 ， 何 斌 ， 刘梦婷 ，杨 娜 ， 裘钧陶 ， 钟世欢 ，汪庆旗 ， 杨 琳

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江 杭州 310009；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江 杭州 310009）

水溶性维生素是维持人体正常生命活动不可缺少且需求量较少的一类有机化合物，其中一些维生素在人体内不能合成或者合成的量不能满足人体的需要，必须由食物供给，但是水溶性维生素摄入过量或缺乏都将导致各种疾病[1]。目前，很多食品中都会添加水溶性维生素，但其是否符合要求还有待进一步检测验证。因此，加大对水溶性维生素检测技术的研究，快速检测食品中水溶性维生素含量，对于人们科学摄入水溶性维生素具有一定的指导意义，同时，对于科学控制水溶性维生素在食品中的添加量也具有重要意义。

目前，我国国标只对单一或者2～3种水溶性维生素进行检测，其中牛磺酸、维B1（硫胺素）、维B2（核黄素）、维B3（烟酸、烟酰胺）、维B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺） 主要用高效液相色谱测定；维B5（泛酸）、维B9（叶酸）、维B12（钴胺素） 和维H（生物素） 主要用微生物法测定。这些方法前处理繁琐、检测周期长、成本高，不能满足多种物质快速同时检测的要求[2]。所以试验拟运用HPLC-MS/MS联用技术，建立同时检测食品中12种水溶性维生素（牛磺酸、维B1、维B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、叶酸、维B12、生物素） 的快速检验方法，针对不同样品的前处理进行优化，可大大提高检测效率，对于科学控制水溶性维生素在食品中的添加量具有重要意义[3]。

1 试验部分

1.1 材料与试剂

除非另有说明，所有试剂均为分析纯；水为GB/T 6682规定的一级水。

乙腈 （色谱纯），美国Tedia公司提供；甲酸（优级纯），上海安谱科学仪器有限公司提供；乙酸铵、冰乙酸、盐酸、三氯乙酸（分析纯），杭州化学试剂有限公司提供；牛磺酸、维B1、维B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、叶酸、维B12、生物素标准物质 （含量≥99%），Dr.Ehrenstorfer公司提供。

标准溶液的配置：牛磺酸、维B1、维B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、维B12、生物素标准物质各称取0.05 g至50.00 mL容量瓶，用0.01 mol/L盐酸定容，配制成1 000μg/mL标准储备液，叶酸称取0.05 g至50.00 mL容量瓶，用少量稀氨水溶解后，再用浓度为0.01 mol/L盐酸定容，配制成1 000μg/mL标准储备液。再用水稀释成适当质量浓度的混合标准工作液。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 InfinityⅡ型超高效液相色谱仪（配备二元梯度泵、自动进样器、柱温箱等）；Agilent 6470型三重四极杆质谱仪；TGL-16G型高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；Milli-Q型纯水仪，美国Millpore公司产品。

1.3 分析步骤

1.3.1 样品前处理

（1） 果汁饮料。 称取试样5 g（ 精确至0.01） 于100 mL容量瓶中，用浓度为0.01 mol/L盐酸溶液定容至刻度，混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤后，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

（2） 含乳饮料。 称取试样5 g（ 精确至0.01） 于100 mL容量瓶中，加入10 mL质量浓度为40 g/L三氯乙酸溶液，混匀，超声提取20 min，用水定容至刻度，取适量溶液以转速4 000 r/min离心5 min。取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤后，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

（3） 奶粉。 称取试样1 g（精确至0.01） 于100 mL容量瓶中，加入50 mL 45～50℃的水溶解，混匀后超声处理30 min，待溶液温度降至室温后，用冰乙酸调节pH值至4.50左右，用水定容至刻度，取适量溶液以转速4 000 r/min离心5 min。取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤后，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

1.3.2 测定

（1） 色谱柱。Agilent SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm， USA）。

柱温35℃，进样体积5μL，流速0.3 mL/min，流动相A为浓度5 mmol/L乙酸铵，流动相B为乙腈。

梯度洗脱程序见表1。

（2） 质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子，检测方式为多反应监测（MRM）方式采集，毛细管电压4.0 kV，雾化器 （N2） 压力45 psi； 干燥气 （N2） 温度 350℃， 干燥气 （N2） 流速10 L/min。

表1 梯度洗脱程序

12种水溶性维生素的质谱检测参数见表2，12种水溶性维生素MRM色谱图见图1。

表2 12种水溶性维生素的质谱检测参数

2 结果与分析[6-8]

2.1 线性关系和检测限

将标准溶液工作液按由低到高质量浓度进样，在上述仪器条件下测定，分别以质量浓度为横坐标、以对应的峰面积为纵坐标绘制，标准曲线得到线性方程。

12种水溶性维生素线性及检出限见表3。

由表3可知，12种水溶性维生素在各自标准曲线质量浓度范围内线性良好。

2.2 精密度和回收率

对3种不同基质样品分别进行3个质量浓度水平6次加标回收试验，考查精密度和回收率。

图1 12种水溶性维生素MRM色谱图

表3 12种水溶性维生素线性及检出限

12种水溶性维生素精密度及回收率试验见表4。

由表4可知，12种水溶性维生素加标样品回收率为78.5%～89.4%，相对标准偏差（RSD） 为2.00%～4.99%，该方法具有较好的精密度，能满足实际样品的检测需要。

2.3 结果计算和表达

试样中目标物的含量X，以μg/kg表示，按式计算：

式中：C——试样溶液的质量浓度，ng/mL；

V——试样溶液的体积，mL；

m——试样的质量，g；

n——样液稀释倍数。

注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。

3 结论

12种水溶性维生素在相应质量浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.999，不同样品基质中（果汁饮料、乳饮料、奶粉） 在3个质量浓度水平加标试验回收率在78.5%～89.4%，相对标准偏差（RSD） 为2.00%～4.99%， 方法检测限 （LOD，S/N≥3）为 5.0μg/kg，定量限为20.0μg/kg。经方法学验证，该方法简便快速、重现性好、灵敏度高、结果可靠，适用于食品中12种水溶性维生素的快速筛查和定量测定。

超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定食品中牛磺酸、维B1、维B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、叶酸、维B12、生物素的方法。样品用水提取，提取液离心过滤后动态多反应监测方式测定。与目前的国家标准和文献报道的方法相比，该方法在保证准确性好、灵敏度高的同时，尽可能省去了复杂的前处理，为食品中同时快速测定多种维生素的研究提供了数据和基础。

表4 12种水溶性维生素精密度及回收率试验