地尔硫卓对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化的保护作用研究

范丽 姚亚妮 李瑜

心肌纤维化会引起心脏心室壁增厚，诱发心肌重构最终导致心力衰竭，主要表现为细胞外基质过度沉积和胶原比例失调且排列紊乱[1]。异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)作为β-肾上腺素能受体的激动剂，通过介导儿茶酚胺的自氧化产生高细胞毒性的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，导致心脏功能紊乱[2]。

地尔硫卓通过结合细胞膜上的钙通道蛋白来抑制钙离子内流，能够有效缓解心绞痛、心力衰竭和动脉粥样硬化等心血管疾病[3-4]。尚未有研究报道其对心肌纤维化的保护作用。本研究旨在评价地尔硫卓对大鼠心功能、血流动力学以及组织形态学和胶原沉积的影响，从抗氧化和抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路两方面探讨地尔硫卓对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化发挥保护作用的机制。

材料与方法

1.实验材料 (1)试剂：地尔硫卓购买自天津田边制药有限公司(国药准字H12020126，1506042)。异丙肾上腺素购买自Sigma公司。戊巴比妥钠购买自北京化学试剂公司。HE染色试剂盒购买自武汉博士得生物工程有限公司。Masson试剂盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)检测试剂盒购买自南京建成生物工程研究所。Collagen I和Collagen III抗体购买自北京博奥森公司，S-P免疫组化试剂盒购买自北京中衫金桥生物技术有限公司。NF-κB、转录生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)以及GAPDH等单克隆抗体均购买自Cell signal公司，山羊抗兔HRP-IgG购买自Santa Cruz公司。BCA蛋白测定试剂盒购买自北京索莱宝生物科技有限公司，超敏ECL化学试剂盒购买自上海西唐生物科技有限公司。

(2)实验动物：SPF级，雄性，Sprague-Dawley大鼠，30只，6周龄，体质量220～260 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产合格证号：65000700000045。动物饲养环境SPF级，分笼饲养，可自由获取水和食物，12 h交替照明，室温保持在(22±1)℃，湿度45%～65%，整个动物实验过程严格遵照“Guide for the care and use of laboratory animals from the national institutes of health”[5]。

2.方法 (1)动物分组及给药：30只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、模型组和地尔硫卓组。除正常对照组，其他两组均采用皮下注射异丙肾素的方法构建心肌纤维化模型，2 mg·kg-1·d-1连续注射10d[6]。地尔硫卓组以灌胃的方法给予10 mg·kg-1·d-1地尔硫卓。正常对照组和模型组的大鼠灌胃给予等量0.9%氯化钠溶液，连续给药4周。

(2)心电图和血流动力学检测：体表心电图的检测判断大鼠心功能。大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，取仰卧位固定于恒温鼠板上，用四肢电极分别插入大鼠肢端皮下，在用心电图电极固定在双上肢(右上肢红色、左上肢黄色)和双下肢(左下肢绿色、右下肢黑色)，使用RM6240生理信号采集处理系统记录标准II导联心电图。

左心室插管术检测血流动力学指标[7]。暴露颈动脉，结扎心脏远端，用动脉夹夹住近心端，血管下穿线备用，动脉壁上行一斜切口，将充满肝素0.9%氯化钠溶液的动脉插管由切口向心脏方向插入动脉。松开动脉夹，推进动脉插管并扎紧，5～10 min后记录麻醉状态下血流动力学指标。

(3)HE染色和Masson染色及S-P免疫组织化学法：HE染色：待大鼠麻醉后腹主动脉取血，快速取出心脏组织，经0.9%氯化钠溶液冲洗后，分离出心脏左心室上部组织，4%多聚甲醛固定24 h。乙醇逐级脱水，二甲苯、石蜡处理，包埋并制成4 μm厚的切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精-伊红染色后，进行乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后进行镜下拍照并观察心肌形态变化。

Masson染色：取心脏左心室上部组织制成石蜡切片，预热经常规石蜡脱水后行双蒸水洗涤。首先滴加Masson复合染色液染色5 min后，0.2%乙酸溶液清洗30 s，滴加10%磷钨酸分化8 min，0.2%乙酸溶液清洗3次。加苯胺蓝染色5 min后再次用0.2%乙酸溶液清洗3次。最后经乙醇逐级脱水后，使用二甲苯透明，中性树胶封片。待片子干燥后，镜下拍照并观察大鼠心脏组织胶原沉积的变化，胶原纤维呈蓝色，胞质、心肌细胞呈红色。计算心肌胶原容积分数CVF(%)＝心肌胶原面积/所测视野面积×100%。

S-P免疫组化法：左心室肌组织标本固定和石蜡包埋同HE和Masson染色，经脱蜡、水化、煮沸法修复，按照 S-P免疫组化试剂盒说明书操作。Collagen I和Collagen III的一抗分别以1∶400和1∶600的比例稀释。显微镜下拍照并随机选取五个视野。用Image-Pro plus 6.0计算Collagen I和Collagen III阳性面积。

(4)心肌组织中SOD、GSH-Px、MDA水平的检测：取各组心肌组织，加入pH7.2 PBS匀浆稀释成1%的组织匀浆，离心后收集上清以检测心肌组织中SOD、GSH-Px、MDA等氧化应激标志物的含量。测定按照SOD、GSH-Px、MDA试剂盒说明书进行。

(5)心肌组织中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白表达水平的检测：蛋白免疫印迹法检测各组大鼠心肌组织中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白的表达水平。取各组大鼠心肌组织各100 mg，剪碎后加入裂解液和 PMSF，冰上匀浆后裂解 30 min。4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清，BCA定量待测样品总蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳后，湿转法将蛋白条带转移到PVDF膜上。5%BSA室温封闭2 h，TBST 洗膜。 加入 NF-κB、TGF-β1、CTGF 的单克隆抗体，4℃摇床孵育过夜，TBST清洗。加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下振荡孵育1 h，TBST清洗。滴加ECL超敏显色液显色后采用凝胶成像仪曝光，运用Image J获得灰度值。

3.统计学方法 通过SPSS22.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，通过One-Way ANOVA单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.地尔硫卓对心电图和血流动力学指数的影响正常对照组的心电图模式正常如图1 A所示。而模型组的心电图S-T段和T波的振幅明显升高，QRS波的峰值衰减如图1B所示(P＜0.05)。地尔硫卓组心电图如图1C所示，QRS波的峰值和且S-T段和T波的振幅有所恢复，说明地尔硫卓能逆转因异丙肾上腺素引起的心功能障碍(P＜0.05)。

血流动力学结果显示，与正常对照组相比，模型组的HR和LEVDP显著升高，而LVSP和±dp/dt max显著降低(P＜0.05)。地尔硫卓组的 HR、LVEDP显著低于模型组，而LVSP和±dp/dt max明显高于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图1 各组大鼠的ECG检测结果波形代表图 A：正常对照组；B：模型组；C：地尔硫卓组

表1 三组大鼠的血流动力学检测结果(±s)

表1 三组大鼠的血流动力学检测结果(±s)

注：与正常对照组相比较，∗P＜0.05；与模型组相比较，#P＜0.05

项目 正常对照组 模型组 地尔硫卓组LVSP/mmHg 141.39±1.88 109.84±6.47∗ 127.43±7.26#LVEDP/mmHg 6.01±0.34 11.45±0.18∗ 7.59±0.32#+dp/dt max/(mmHg/s) 13 832±56.73 10 057±81.64∗ 12 733±68.75#-dp/dt max/(mmHg/s)-5 792.12±39.74 -11 893±92.12∗ -7 138±59.37#HR/(Beats/min) 308.14±5.27 395.49±4.81∗ 324.63±4.95#

2.HE染色、Masson染色和免疫组化法 HE染色观察地尔硫卓对心肌组织病理改变的影响。结果显示，正常对照组心肌细胞形态结构清楚且排列规则。模型组心肌细胞间质增加，细胞断裂且排列紊乱，横纹肌消失，炎性细胞增多，伴有出血坏死。地尔硫卓组心肌排列紊乱和出血坏死程度明显改善，出现极少量炎性细胞浸润。

图2 地尔硫卓对心肌组织形态学和胶原纤维沉积的影响 A：各组大鼠心肌组织的HE染色，Masson染色以及Collagen I和Collagen III的免疫组织化学代表图(×200)。B：各组大鼠心肌组织中的胶原容积分数，Collagen I和Collagen III阳性率的结果统计图。注：与正常对照组相比较，∗P＜0.05；与模型组相比较，#P＜0.05

Masson染色结果中，正常对照组心肌间质可见少量正常纤维化。模型组可见大量蓝色的胶原纤维(P＜0.05)，其胶原容积分数(CVF)较正常对照组显著增加(P＜0.05)。地尔硫卓组有部分间质可见纤维化，有少量胶原纤维沉积，其CVF显著低于模型组(P＜0.05)。

免疫组织化学结果显示，模型组Collagen I和Collagen III的阳性面积率显著高于正常对照组(P＜0.05)。地尔硫卓组Collagen I和Collagen III的阳性面积率显著低于模型组(P＜0.05)。

3.地尔硫卓抑制ISO诱导的氧化应激反应 为了探究地尔硫卓保护心肌纤维化的作用机制，检测了SOD、GSH-Px和 MDA等指标，见表2。结果发现，模型组SOD、GSH-Px含量显著低于正常对照组(P＜0.05)，MDA 显著高于正常对照组(P＜0.05)。与模型组相比较，地尔硫卓组的SOD、GSH-Px含量显著增加(P＜0.05)，而 MDA含量显著降低(P＜0.05)。

表2 地尔硫卓对SOD、GSH-Px、MDA等含量的影响(±s)

表2 地尔硫卓对SOD、GSH-Px、MDA等含量的影响(±s)

注：与正常对照组相比较，∗P＜0.05；与模型组相比较，#P＜0.05

类别 正常对照组 模型组 地尔硫卓组SOD/(U/mg prot) 12.97±2.31 6.35±1.84∗ 10.62±2.19#GSH-Px/(mg·mL-1) 4.89±0.18 2.21±0.24∗ 3.81±0.19#MDA/(U/mg prot) 6.58±0.72 13.47±1.13∗ 8.25±0.84#

4.心肌组织中 NF-κB、TGF-β1、CTGF 等蛋白的表达水平检测 进一步检测各组大鼠心肌组织中NF-κB、TGF-β1、CTGF 等涉及心肌纤维化分子机制的蛋白的表达水平，来探讨地尔硫卓发挥保护作用的机制。 与正常组相比，模型组中 NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表达水平显著增加(P＜0.05)。与模型组相比，地尔硫卓组中 NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表达水平显著降低(P＜0.05)，见图3。

图3 地尔硫卓对大鼠心肌组织中NF-κB、TGF-β1、CTGF蛋白表达水平的影响 A：蛋白免疫印迹结果图。B：各组大鼠心肌组织中NF-κB、TGF-β1、CTGF等蛋白的表达水平的统计图。注：与正常对照组相比较，∗P＜0.05；与模型组相比较，#P＜0.05

讨 论

心肌纤维化是一个复杂的病理过程，广泛存在于各类心血管疾病的发生发展过程中，如心律失常、心力衰竭及心肌肥厚等[8]。大剂量的ISO通过自身氧化而诱导大量自由基的生成和聚集，从而引起膜通透性的变化，进一步引起胶原沉积和心肌纤维化，使心肌舒张和收缩功能受到抑制[9]。本实验通过异丙肾上腺素建立心肌纤维化大鼠模型，探讨地尔硫卓对心肌纤维化的保护作用及其作用机制。

心电图和血流动力学检测是评价药物对心血管功能影响的一种常用方法[10]。心电图结果发现，地尔硫卓能抑制异丙肾上腺素引起的QRS波的峰值和S-T段以及T波的改变，这提示地尔硫卓能改善心肌纤维化大鼠的心功能。临床上常用LVEDP表示心脏的容量负荷，间接反应舒张功能，其升高会导致心肌细胞内线粒体数目增加，增加了心肌细胞耗氧量，使得胶原纤维合成增加[11]。LVSP和+dp/dt max反映心脏收缩功能[12]。其中LVSP代表等容收缩期左心室内压力的变化，而+dp/dt max反应室壁肌张力上升的变化速率。-dp/dt max是评价心肌舒张功能的客观指标，反映左心室的充盈程度和舒张功能及顺应性。血流动力学检测结果发现，模型组HR、LVEDP升高，而LVSP和±dp/dt max降低说明ISO诱导使得大鼠心肌收缩和舒张功能降低。而地尔硫卓组的HR和LVEDP显著低于模型组，同时LVSP、±dp/dt max等上升。说明地尔硫卓能改善ISO引起的左心室收缩和舒张功能不全。

心肌纤维化即心肌纤维胶原网的重构，可通过Masson染色和免疫组化判断心肌纤维化和胶原沉积情况。有研究表明，Collagen I和III是心肌胶原基质的主要结构蛋白，其含量是反映心脏舒张功能的客观指标[13]。An等[14]发现I、III型胶原蛋白的表达量的增加诱导心肌纤维化的发生，阿托品的干预可以通过降低I、III型胶原蛋白的含量改善心肌纤维化的严重程度。本研究通过HE和Masson染色发现，地尔硫卓能显著改善ISO引起的心肌结构紊乱和间质纤维化沉积现象。免疫组化检测结果显示，Collagen I和Collagen III的表达能被地尔硫卓显著下调。

SOD、GSH-Px等内源性抗氧化酶是体内维持氧化/抗氧化平衡和清除自由基的首要物质[15]。氧化应激主要由ROS介导，能够造成机体SOD、GSH-Px等抗氧化物质被大量消耗，进而引起生物膜中脂质成分发生氧化并产生MDA[16]。本研究结果显示，ISO诱导后，大鼠氧化应激反应增强，心肌细胞合成的抗氧化酶减少，无法清除心肌细胞内积聚的自由基，加剧心肌纤维化的进程。地尔硫卓可通过增加大鼠心肌中SOD、GSH-Px含量，减少MDA的合成，对心肌纤维化产生抑制作用。

为了进一步探讨地尔硫卓改善心肌纤维化的分子机制，通过免疫印迹法检测了心肌组织中与促纤维化相关的相关蛋白 NF-κB、TGF-β1和CTGF等蛋白的表达情况。NF-κB信号通路是调节纤维化反应的经典通路，其下游蛋白TGF-β1是关键的致纤维化因子，促进心脏成纤维细胞增殖和活化成肌成纤维细胞，进而上调I型和III型胶原蛋白表达[17-18]。有研究指出，TGF-β1的表达可以促进主动脉狭窄患者的心肌纤维化进程[19]。CTGF因具有明显的丝裂原性和趋化性，能诱导成纤维细胞增殖，是发生心肌纤维化的重要因子[20]。免疫印迹结果显示，模型组NF-κB、TGF-β1 和 CTGF 的表达显著高于正常对照组，提示心肌纤维化与NF-κB信号通路的激活有关。与模型组相比，地尔硫卓组的 NF-κB TGF-β1和CTGF等蛋白的表达显著降低，提示地尔硫卓介导NF-κB信号通路抑制心肌纤维化。

有研究认为ISO引起的心肌纤维化损伤与Ca2+超载和ROS产生有关。ROS的过度生成通过激活NF-κB通路来诱发促炎反应和细胞凋亡的发生[21]。TGF-β和CTGF是NF-κB的下游促纤维化的蛋白，其表达上调可引起细胞外基质的过度沉积，引起心肌纤维化[21-22]。地尔硫卓一方面通过抗氧化应激来抑制NF-κB信号通路，另外一方面通过直接作用于NF-κB，从而引起下游的 CTGF下调，CTGF的下调介导了Collagen I和Collagen III的下调，即抑制了心肌纤维化的发生。综上所述，地尔硫卓能改善心肌纤维化大鼠的心功能和血流动力学，减少心肌结构损伤和胶原沉积情况，其作用的发挥与抗氧化应激和抑制NF-κB信号通路有关。