生物酶法水解海鱼皮的研究

■程 瑛 王 冠 吕梦娴 刘 营

（武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉430074）

2017年渔业年鉴显示：全国水产总量6 445.33万吨，比上年增长1.03%；在国内渔业生产中，海水养殖鱼类产量为141.94万吨，比上年增加12.70万吨，淡水养殖鱼类2 540.98 万吨，比上年增长0.88 万吨[1]。随着鱼类产量的不断增长，我国鱼类加工产业不断发展，2017年鱼类的加工量达2 196.25万吨。鱼类加工业的快速发展，产生了大量的副产物，其中主要包括鱼皮，占鱼总重量10%左右[2]。鱼皮中蛋白含量高，是巨大的潜在可利用蛋白资源，可用来制备胶原蛋白、明胶等产品，而胶原蛋白在医药、化妆品、保健品等高附加值产品领域已经得到广泛的利用，因此，如直接废弃鱼皮会造成严重的资源浪费。

本实验的目的是能够合理的利用水产品下脚料，减少资源浪费，同时可以带来一定的经济效益，开阔水产品下脚料的市场。我国是马哈鱼加工和代加工大国，加工过程中产生大量废弃鱼皮。因此，本实验以海鱼皮马哈鱼皮为实验材料。马哈鱼是名贵冷水鱼，其鱼皮胶原蛋白或明胶与其他鱼类相比有自身特点，更易被吸收利用，被认为是开发胶原蛋白肽等功能产品的良好资源，具有广阔的市场开发价值。国内外利用鱼皮提取明胶的研究很多，所用鱼皮原料多为鲨鱼鱼皮[3]、草鱼鱼皮[4]和单角革鲀鱼鱼皮[5]等，但是对马哈鱼鱼皮提取明胶或者其他功能型胶原蛋白的研究较少。且国内未见马哈鱼鱼皮加工利用的相关报道，国外对马哈鱼鱼皮的加工利用研究也鲜有报道。

国内外很多的报道对鱼皮的处理采用强酸碱的方法，此种处理方法不仅对环境污染大，并且操作复杂，耗时较长且危险，本实验不采用传统的酸碱处理方法，直接采用环保安全的酶解法来处理马哈鱼鱼皮，得到目标分子量的小肽，并且减少环境污染。根据国际标准规定，平均分子量≤500 Da 称为小肽，平均分子量1 000～3 000 Da称为多肽，平均分子量3 000～5 000 Da称为大肽。本实验希望通过酶解法能够得到目标分子量的肽，且比较几种酶解法的可行性。

1 材料与方法

实验用水应符合GB/T 6682 中二级用水的规格，使用试剂除特殊规定外，均为分析纯。

1.1 试剂材料

1.1.1 酶制剂

碱性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶均来源于武汉新华扬生物股份有限公司。海鱼皮为马哈鱼皮。

1.1.2 试剂和仪器

硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、浓盐酸、无水碳酸钠、溴甲酚绿-甲基红指示剂、三氯乙酸（国药集团），乙腈、三氟乙酸（色谱纯），细胞色素C、抑酞酶、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（中国计量科学研究院）等试剂。

THZ-82 恒温水浴摇床（常州国华），凯氏定氮仪（Foss），高效液相色谱仪（安捷伦）：配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪，凝胶色谱柱（赛分科技）。

1.2 方法

1.2.1 海鱼皮的酶解反应

按照马哈鱼皮与水的质量比1∶4的比例配制鱼皮水混合液，其中水的pH值提前使用10%的碳酸钠调节至8.0～9.0，记录反应器和鱼皮水混合液的总重，在50 ℃恒温水浴摇床中预热5～10 min，按照各添加量加酶制剂，搅拌均匀，继续于50 ℃恒温水浴摇床中酶解2 h，酶解完成之后，沸水浴灭酶10 min，冷却，定重，检测各项指标。

1.2.2 水解度

凯氏定氮法测定。

1.2.3 酸溶蛋白

TCA法测定。

1.2.4 肽分子量检测

色谱柱：SRT SEC-150 7.8×300 mm（内径）或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱。流动相：乙腈+水+三氟乙酸=19.98+79.92+0.1。检测波长：220 nm。流速：0.5 ml/min。检测时间：33 min。进样体积：20 μl。柱温：25 ℃。

相对分子量标准曲线制作：分别用流动相配制成质量浓度为1 mg/ml的上述不同相对分子质量肽标准品溶液，按一定比例混合后，用孔径0.2～0.5 μm 有机相膜过滤后进样，得到标准品的色谱图。以相对分子质量的对数对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。

1.2.5 不同的酶制剂

a 组：碱性蛋白酶：添加量分别为质量分数0.30%、0.40%、0.50%、0.60%；

b 组：中性蛋白酶：添加量分别为质量分数0.36%、0.48%、0.60%；

c 组：木瓜蛋白酶：添加量分别为质量分数0.23%、0.30%、0.46%；

d组：木瓜蛋白酶∶碱性蛋白酶=1∶3：添加量分别为质量分数0.50%、0.60%、0.70%、0.80%。

以上四组实验的添加量设计原则为保持四种配方的成本一致。按照上述四组实验配制实验用酶制剂，对马哈鱼皮进行酶解实验，比较常见指标水解度、酸溶蛋白、肽分子量≤1 500 Da 的分布。实验设计组如表1。

2 结果

2.1 不同添加量的碱性蛋白酶酶解效果

马哈鱼皮通过不同添加量的碱性蛋白酶酶解之后的各项指标见表2，从表2中可看出，添加量逐渐加大，其水解度和酸溶蛋白的变化小，无法比较出哪个添加量的酶解效果好，从肽分子量≤1 500 Da分布可看出，碱性蛋白酶的添加量为0.3%时最差，添加量逐渐增大，目标肽分布面积逐渐变大，但趋势并不明显，因此，可以根据对分子量的需求来确定碱性蛋白酶的添加量。

表1 实验设计组

表2 不同添加量的碱性蛋白酶的酶解结果

图1 中标准品，从10 min 开始出现四个明显的峰，依次为细胞色素C（分子量为12 500 Da）、抑酞酶（分子量为6 500 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（简称四肽，分子量为451 Da）和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（简称三肽，分子量为189 Da）；添加量为0.3%的碱性蛋白酶，在10 min 之前出现一个峰，根据标准品信息可断定此峰的化合物分子量在12 500 Da 以上，说明此添加量下，存在未被酶解的化合物，因此需加大碱性蛋白酶的添加量。比较另外三个添加量，从色谱图可看出，在15～25 min之间，三组添加量的肽分子分布基本重合，差异表现在峰面积有所不同，添加量越大，峰面积越大，但是递增趋势并不明显。

图1 不同添加量的碱性蛋白酶酶解之后高效液相色谱图

从表2 和图1 可看出，随着碱性蛋白酶添加量的改变，有明显变化的是添加量从0.3%到0.4%，分子量≤500 Da的肽分布面积增大，从0.4%开始的添加量各指标显示分子量1 500 Da 以上的肽的分布变化差异不明显。四组添加量中水解度、酸溶蛋白这两项指标并无明显差异。

2.2 不同添加量的中性蛋白酶酶解效果

马哈鱼皮通过不同添加量中性蛋白酶酶解之后的各指标见表3，从表3 可看出，添加量逐渐增大，其水解度和酸溶蛋白的变化差异小，而酶解之后肽分子量≤1 500 Da的分布比例增大。

图2中标准品分析同图1分析。从色谱图中可看出，三种添加量的中性蛋白酶出现的峰基本重叠，差异在于峰高不同，依次为0.60%的中性蛋白酶＞0.48%的中性蛋白酶＞0.36%的中性蛋白酶，因此，从色谱图来看，添加量越高，出现重叠部分的峰面积越大，说明添加量增大，各目标肽的含量在增加。

从表3 和图2 可以看出，目标肽的分布面积在缓慢增大，但并不明显，当中性蛋白酶的添加量到0.60%，分子量≤5 000 Da的肽的分布面积达到90%左右，说明中性蛋白酶添加量到一定的量时，完全可以都酶解为分子量为5 000 Da的肽。

表3 不同添加量的中性蛋白酶的酶解结果

图2 不同添加量的中性蛋白酶酶解之后高效液相色谱图

2.3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解效果

马哈鱼皮通过不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后的各项指标见表4，从表4 中的各指标可以看出，随着添加量的增大，酸溶蛋白几乎无变化，水解度先增加后降低，而肽分子量基本上都在1 000 Da以下，说明木瓜蛋白酶的效果很好，如果目标肽分子量需求是1 000 Da 以下，可以选取合适添加量的木瓜蛋白酶。

表4 不同添加量的木瓜蛋白酶的酶解结果

表4中木瓜蛋白酶的添加量在增加，分子量300 Da以下的有差异，有下降的趋势，而分子量1 000 Da 以下的差异不明显。

图3中标准品分析同图1分析。从色谱图上可看出，三种添加量的木瓜蛋白酶出现的峰基本重叠，最高峰值的保留时间离四肽较近，并且三组不同的添加量下，仅出现一组比较明显的峰，可见，经过木瓜蛋白酶酶解之后的肽基本集中在一起，并且三种不同的添加量的木瓜蛋白酶的出峰的峰高也基本重合，说明木瓜蛋白酶的添加量可以更少。

从表4 和图3 可以看出，木瓜蛋白酶的作用效果很明显，酶解之后的肽分子量大多≤1 000 Da，根据下游产品的需求，如果希望鱼皮酶解之后多为≤1 000 Da，可选择采用木瓜蛋白酶进行酶解。

图3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后高效液相色谱图

2.4 不同添加量的复合酶制剂（木瓜蛋白酶∶碱性蛋白酶=1∶3）酶解效果

马哈鱼皮通过不同添加量的复合酶制剂酶解之后的各项指标见表5，从表5中各指标可以看出，复合酶制剂添加量为0.8%时，水解度最高，酸溶蛋白最高，但是分子量≤1 000 Da的肽分布面积反而降低，而添加量为0.7%的分子量≤1 000 Da的肽分布比例最高；其次，复合酶制剂添加量增加，分子量≤300 Da的肽分布比例增加，当添加量到0.80%时，出现下降趋势，说明复合酶的使用不能提高小肽含量，可以明显提高多肽的含量。

表5 不同添加量的复合酶制剂的酶解结果

图4中标准品分析同图1分析。从图4上可以看出，除了添加量为0.80%复合酶制剂的峰高比较高，其他三条基本重合，说明0.5%、0.6%、0.7%三个梯度，随添加量增加，并不明显增加≤3 000 Da肽的含量。

3 讨论

3.1 不同添加量的碱性蛋白酶和中性蛋白酶对马哈鱼皮的酶解

碱性蛋白酶和中性蛋白酶均是一种内切酶，多属于丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶催化底物蛋白质水解时通常有两个步骤：在水解过程中，随着氨基酸的丢失和肽链的断裂还形成共价酶-肽复合的中间二聚体；然后脱去酰基，通过水对中间体的亲核攻击，从而使底物肽键水解。碱性蛋白酶的酶切位点主要断裂疏水氨基酸的C 末端，可特异性切割谷氨酰胺-组氨酸、丝氨酸-组氨酸、亮氨酸-酪氨酸、酪氨酸-苏氨酸之间的肽键[6]。而中性蛋白酶对酶切位点无特异性。两种酶的作用效果来看，中性蛋白酶的水解度稍差。从分子量的分布情况来看，两者的小肽含量分布面积较高，肽分子量≤5 000 Da 的分布情况在成本一致的情况下，随着添加量的增大基本趋于一致。由于酶解马哈鱼皮之后需制作的产品的要求各不相同，因此，可以根据产品需求选择相应的配方。

3.2 不同添加量的木瓜蛋白酶对马哈鱼皮的酶解

木瓜蛋白酶是一种内切酶，属于巯基蛋白酶，可水解绝大多数肽键，但对不同肽键水解的速率相差较大，该酶对蛋白质或多肽中精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸的羧基形成的肽键非常敏感[7-10]。它的作用机制为：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生，然后Cys-25亲核攻击主链上的羧基端，并与之共价链接形成酰基-酶中间体，接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羧基末端，他的酶切位点具有广泛特异性，主要包括Arg-、Lys-、Phe-X-。木瓜蛋白酶属于动物性水解蛋白酶，从酶解之后的水解度来看，添加量变大，水解度出现下降趋势，但是小肽含量的分布情况变化不大，集中在300～1 000 Da，如果产品对小肽要求含量比较高，木瓜蛋白酶是个很好的选择。

图4 不同添加量的复合酶制剂酶解之后高效液相色谱图

3.3 不同添加量的复合酶制剂对马哈鱼皮的酶解

复合酶制剂包括木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，这两种酶均属于内切酶，但是两种酶均有各自专属的肽键切割位点，其水解活力均较高，因此可将这两种酶组合使用。组合使用之后水解度均达到80%以上，小肽含量随着添加量的增加先增大后减小，分子量3 000 Da以下肽的变化差异小。可根据产品需求选择合适的添加量配方。

4 结论

①本实验选取的四组酶制剂配方，其水解度都达到80%以上，碱性蛋白酶效果更佳；酸溶蛋白的含量均在2.0%左右，差异不明显。

②从整体的分子量分布来看，木瓜蛋白酶的效果最好，酶解之后基本都是小肽，其次是碱性蛋白酶，其次是中性蛋白酶，复合酶制剂效果最差。