食管鳞癌组织中miR-125a和miR-125b的表达及其与临床病理特征的关系

窦维佳,王景杰,胡 博,周金池,李丽丽,刘震雄

(中国人民解放军空军军医大学(第四军医大学)唐都医院消化内科,西安 710038;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:liuzhx816@126.com)

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤,其致死率高[1,2],可分为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)及食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)两种病理类型,在我国90%的食管癌患者为ESCC[3,4]。ESCC的发生是一个多因素、多步骤的生物学过程[5],虽已进行了多年研究,但其发病机制尚不十分明确。microRNA(miRNA)是一类短链非编码RNA分子,其长度约为18-25个核苷酸。miRNA通过与特定mRNA的3′UTR区结合,导致mRNA降解,抑制蛋白质翻译,在转录后水平调控基因表达,在细胞分化、发育、稳态等多种生物学过程中发挥重要作用[6,7]。大量研究证实,miRNAs参与多种肿瘤的发生发展,并发挥重要的调节作用,与疾病诊断及预后密切相关[8]。microRNA-125(miR-125)家族包含miR-125a和miR-125b两个成员,研究发现miR-125a和miR-125b在胰腺癌、肝癌、乳腺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤中扮演癌基因或抑癌基因角色[9-12],但其在食管癌中的表达及作用尚不十分明确。本研究拟通过收集组织样本,应用RT-PCR方法检测食管癌、癌旁及转移淋巴组织中miR-125a和miR-125b的表达情况,分析miR-125a和miR-125b与食管癌临床病理特征的关系,及两者在肿瘤组织中表达的相关性,探讨miR-125a和miR-125b在食管癌中的作用,并评价其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2015-09～2018-09经空军军医大学唐都医院手术切除的食管癌组织75例,同时取距癌组织边缘>5 cm处的正常组织标本作为癌旁组织,取淋巴结转移患者的转移淋巴结组织30例,所有组织标本均经病理确诊为食管鳞状细胞癌。所有标本保存于液氮中备用。75例食管癌患者中,男性46例,女性29例,年龄35-80岁,中位年龄58.2岁。所有患者术前均未接受其他相关治疗措施。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 取食管癌、癌旁及转移淋巴结组织标本分别放入液氮预冷的研钵中,研磨成粉末后,加入1 ml的TRIzol,按照TRIzol试剂说明书常规提取不同组织RNA,用紫外分光光度计对所提取的RNA进行定量。

1.2.2 实时定量PCR 将所提取的RNA应用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒,以37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s的反应条件合成cDNA。随后按照SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒使用说明书,以合成的cDNA为模板进行实时定量PCR。反应条件为:95 ℃ 5 min变性;95 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,共45个循环。溶解曲线分析:95 ℃ 5 s,50 ℃ 1 min,97 ℃(1个循环),40 ℃ 30 s冷却。以U6作为内参,2-ΔΔCt分析miRNA的相对表达水平。实验重复3次,每次每个样本3个复孔。引物序列见表1,均购自RiBoBio公司。

表1 qRT-PCR扩增引物序列

Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

基因上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′) miR-125aACACTCCAGCTGGGACAGGTGAGGTTCTTGCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGCTCCCA miR-125bTGCGCTCCTCTCAGTCCCTGAGATGCGCTCCTCTCAGTCCCTGAG U6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

1.3 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件分析。以平均表达值作为截点将不同组织中miR-125a和miR-125b的表达分为高表达组和低表达组,采用t检验对两组间差异进行分析,单因素方差分析对多组间差异进行分析,卡方检验对计量资料进行分析,Pearson相关系数检测食管癌组织中miR-125a和miR-125b表达的相关性。所有检验均为双侧,P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-125a和miR-125b在食管癌、癌旁及转移淋巴结组织中的表达

RT-PCR结果显示,与癌旁组织相比,miR-125a在食管癌组织中呈低表达,同样miR-125b在食管癌组织中亦呈低表达,且差异均具有统计学意义(P<0.05,见图1)。另外,miR-125a和miR-125b在转移淋巴结组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.05,见图1)。然而,miR-125a和miR-125b在食管癌及转移淋巴结组织中的表达无明显差异(P>0.05,见图1)。

2.2 miR-125a和miR-125b表达与食管癌临床病理特征的关系

以平均表达值(miR-125a:0.206和miR-125b:0.432)作为截点将miR-125a和miR-125b的表达分为高表达组和低表达组,得到计量资料。结果显示miR-125a和miR-125b表达水平在食管癌及转移淋巴结组织中均显著低于癌旁组织(P<0.05,见表2),而食管癌与转移淋巴结组织中两者的表达无明显差异(P>0.05,见表2)。进一步分析显示,miR-125a和miR-125b表达与食管癌的分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关,即肿瘤分化程度较高、TNM分期较好、无淋巴结转移时，miR-125a和miR-125b高表达(P<0.05,见表3)。miR-125a和miR-125b表达与患者的年龄、性别无明显相关性(P>0.05,见表3)。

与癌旁组织比较,*P<0.05图1 食管癌与癌旁组织中miR-125a和miR-125b的表达Figure 1 Expression of miR-125a and miR-125b in ESCC and adjacent non-tumor tissues

表2 miR-125a和miR-125b在食管癌、癌旁及转移淋巴结组织中的表达

Table 2 The expression of miR-125a and miR-125b in ESCC, adjacent non-tumor and metastastic lymph node tissues

组织 nmiR-125amiR-125b高表达低表达χ2P高表达低表达χ2P 食管癌组织7524516.977a0.008a33427.756a0.005a癌旁组织7540354.688b0.030b49265.649b0.017b转移淋巴结组织309210.040c0.842c12180.063c0.802c

a癌旁组织vs食管癌组织;b癌旁组织vs转移淋巴结组织;c食管癌组织vs转移淋巴结组织

表3 miR-125a和miR-125b在食管癌中的表达及临床病理相关性

Table 3 The relationship between expression of miR-125a and miR-125b and clinicopathological features in ESCC

临床特征 nmiR-125amiR-125b高表达低表达χ2P高表达低表达χ2P 年龄0.0040.9520.8390.360 <60岁4113282021 ≥60岁3411231321性别0.0200.8871.1450.285 男4615311828 女299201514分化程度14.9780.0009.4710.002 高-中分化3519162213 低分化405351129TNM分期16.9300.0005.0660.024 Ⅰ-Ⅱ期2817111711 Ⅲ-Ⅳ期477401631淋巴结转移11.1210.00115.1610.000 否4521242817 是30327525

2.3 miR-125a和miR-125b在食管癌表达中的相关性

Pearson相关系数分析结果显示,miR-125a和miR-125b表达水平在食管癌组织中呈显著正相关(r=0.350,P<0.05,见图2)。

图2 miR-125a和miR-125b在食管癌中表达的相关性Figure 2 Correlation between miR-125a and miR-125b expression in ESCC

3 讨论

食管鳞癌是我国发病率第三,致死率第四的恶性肿瘤[13],严重危害国民的健康及生命。近年来,尽管药物及外科技术等治疗手段取得了巨大的进步,但很多食管癌患者一经发现已是临床晚期,存在局部浸润或/和远处转移,是导致食管癌患者5年生存率较低的主要原因[5]。因此,阐明食管癌发生发展的分子机制,探索新的治疗策略具有重要的临床价值。

本研究中我们利用qRT-PCR分别检测75例结食管鳞癌、癌旁组织及30例转移淋巴结组织中miR-125a和miR-125b的表达,发现与癌旁组织相比,miR-125a和miR-125b表达水平在食管鳞癌及转移淋巴结组织中显著下调,而在食管鳞癌及转移淋巴结组织中无显著差异。miR-125a和miR-125b属于miRNA-125家族成员,高度保守,miR-125a定位于染色体19q13,miR-125b定位于染色体11q24.1。既往研究表明,miR-125a和miR-125b在宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞中呈差异表达,介导肿瘤细胞增殖、侵袭迁移、耐药等恶性生物学行为,作为癌基因或抑癌基因发挥重要的调节作用[14-19]。虽然,Yan等[20]研究发现miR-125a-5p通过激活STAT3信号通路,增强食管癌细胞对顺铂的敏感性,且另有研究表明miR-125b可抑制食管癌细胞增殖,促进细胞凋亡,并通过调节BMF表达发挥作用[21]。但是,miR-125a和miR-125b与食管癌关系及其对食管癌作用的相关研究仍较少,且其具体机制仍不十分明确。本研究中,我们进一步分析发现,miR-125a和miR-125b与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移密切相关,即肿瘤分化程度高,TNM分期早,无淋巴结转移时,miR-125a和miR-125b均呈高表达,miR-125a和miR-125b在食管鳞癌组织中表达呈显著正相关,提示miR-125a和miR-125b在食管鳞癌发生发展中发挥重要的抑癌作用。

综上所述,miR-125a和miR-125b在食管鳞状中呈低表达,且与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移密切相关,这不仅为阐明食管癌发病机制提供了新的理论依据,也为肿瘤的诊治提供了新的潜在靶点,但其具体分子机制仍有待进一步深入研究。