猪源绿色气球菌的分离与鉴定

刘 洁 刘梦龙 曲久燕 张成东* 郭海岩

（1华中农业大学，湖北武汉 430070；2河南牧翔动物药业有限公司猪药市场部，河南郑州 450008）

绿色气球菌（Aerococcus viridans）属于链球菌科（Streptococcaceae）气球菌属（Aerococcus），是气球菌属的代表。该菌属是1953年由Williams等[1]提议设立的一个菌属。绿色气球菌是革兰氏阳性球菌，该菌广泛分布于自然界，如空气、尘埃、植物、动物和人体[2]。它为条件致病菌，在正常条件下一般不表现致病性，而当机体免疫力下降或免疫功能不健全时，可以引起人类心内膜炎、败血症、菌血症以及关节炎等[3，4]，因此在人医临床上受到广泛的关注。但在兽医临床上，关于气球菌的研究相对较少[5]，本试验的开展有助于防治由气球菌引起的感染，为兽医临床提供科学指导和参考依据。

2019年1月份，河南省某猪场保育仔猪大面积发病，临床表现为病猪精神沉郁、共济失调、关节肿胀、采食量下降；剖检主要病变为肺部出血性大叶性肺炎、纤维素性腹膜炎、关节腔滑液浑浊。通过对发病仔猪的内脏器官以及关节积液进行细菌分离鉴定，16S rRNA基因扩增和致病性试验，分离出了8株气球菌，确定该猪场有绿色气球菌感染。

1 试验材料

1.1 病料

病料采自河南某猪场保育发病仔猪的肺脏、脾脏、肾脏、下颌淋巴结以及关节积液。

1.2 试验动物

清洁级雌性昆明小鼠，体重为30 g，购自郑州市中原区玉飞种兔经营部。

1.3 主要试剂与培养基

THB肉汤培养基、THA琼脂培养基以及绵羊鲜血、胎牛血清购自青岛海博生物技术有限公司；基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Premix taq DNA聚合酶购自宝生物生物工程有限公司；DL 2 000 DNA Marker购自百泰克生物有限公司；琼脂糖胶购自上海英俊生物技术有限公司。

表1 PCR引物

2 试验方法

2.1 细菌的分离及纯化

无菌操作台内操作，用灭菌消毒后的剪刀将病料组织表面剪一切口，将切口面蘸于THA琼脂平板（含绵羊鲜血），用无菌接种环将平板上的黏液均匀涂布于平板表面。置于37℃恒温培养箱内培养18～24 h。挑取疑似菌落进行纯化培养，观察菌落形态。

2.2 16S rRNA基因序列的测定

挑取纯化后的单克隆于3 mL THB（含5%胎牛血清）肉汤中，37℃恒温摇床220 r/min震荡培养至对数期。取对数期的新鲜菌液2 mL，1 2000 r/min离心3 min，弃掉上清，按照天根基因组提取试剂盒说明书操作，获得模板，进行16S rRNA PCR扩增。引物是根据16S rRNA通用引物基因序列设计，由北京六合华大基因科技有限公司合成。引物见表1。

反应体系见表2，16S rRNA PCR反应条件如下：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸90 s，反应30个循环；72℃延伸7 min。以无菌水作为阴性对照。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液中130 V电压恒压电泳25 min，然后凝胶成像系统拍照，观察结果后，PCR产物送至北京六合华大基因科技有限公司测序。

表2 PCR反应体系

2.3 系统进化分析

将16S rRNA测定的序列结果通过NCBI网站中BLAST界面进行序列相似性比对。再应用MegAlign程序与GenBank中的9株绿色气球菌参考菌株的基因序列进行比对和同源性分析，并构建遗传进化树。

2.4 致病性试验

将分离纯化的绿色气球菌用THB肉汤（含5%胎牛血清）增菌过夜培养。将试验动物分为4组，每组5只小鼠，从肾脏、脾脏和关节积液中分离到的绿色气球菌各挑取1株（A1、A2、A5）分别腹腔注射小鼠作为试验组，剩余1组腹腔注射等量无菌THB肉汤作为空白对照组，每只小鼠注射量为400 μL。在适宜条件下隔离饲养，每隔6 h观察小鼠发病及死亡情况。

3 结果与分析

3.1 细菌的分离纯化

分离纯化后得到的绿色气球菌在血平板上生长良好，呈灰白色，表面光滑，边缘整齐，菌落较小，形态单一，周围有草绿色的α-溶血环，易与α-链球菌混淆。在THB（含5%胎牛血清）肉汤中生长良好，呈均匀混浊。

3.2 16S rRNA基因序列的测定

分离得到的8株气球菌分别命名为A1～A8，其中从肾脏组织分离到的气球菌命名为A1，脾脏分离到的气球菌命名为A2～A4，关节积液中分离到的气球菌命名为A5～A8。16S rRNA PCR扩增得到1条1 500bp左右的条带，见图1。

图116 S rRNA PCR扩增结果

3.3 系统进化分析

16S rRNA测定的序列结果通过NCBI网站中BLAST界面进行比对，结果均为绿色气球菌。将分离得到的8株气球菌与GenBank中的9株绿色气球菌参考菌株的基因序列进行同源性分析，结果显示，分离菌与9株绿色气球菌参考菌株（菌株来源见表3）的同源性在99.1%～100%之间，见图2。基于16S rRNA基因序列的遗传进化树见图3。

图2 16S rRNA基因序列同源性分析

3.4 致病性试验

试验组小鼠攻毒1 h后，精神明显变得沉郁，反应迟钝，对照组小鼠均正常。但是此后并未表现出致病性，试验组与对照组小鼠均正常存活。说明绿色气球菌在机体条件正常情况下为非致病性菌。

图3 基于16S rRNA基因序列的遗传进化树分析

4 讨论

气球菌属（Aerococcus）细菌是兼性厌氧革兰氏阳性菌，在血平板上产生α-溶血环，与α-链球菌极为相似。镜检成双或四联排列。目前该菌属有5个种，分别为：绿色气球菌（Aerococcus viridans）、尿道气球菌（A.urinae）、柯氏气球菌（A.christensenii）、血气球菌（A.sanguicola） 和人尿气球菌 （A.urnaehominis）[7]。绿色气球菌是气球菌属的模式种。它是条件性致病菌，是一种人兽共患的细菌，广泛存在于自然界。关于气球菌的报道主要在人类医学临床上，在兽医临床上的报道相对较少。2007年，Martín等[8]对58株猪源绿色气球菌的生物学特性进行研究发现，该菌可能是猪的致病菌。2006年，谢彬等[9]从发病仔猪关节积液中分离到绿色气球菌。2017年，董文龙等[10]从病死猪肺脏中分离到绿色气球菌，致病性试验结果表明该菌对仔猪具有致病性。

本次研究以河南省某猪场保育仔猪大面积发病为基础，根据发病仔猪临床症状，采取发病猪的肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结以及关节积液进行细菌的分离纯化，16S rRNA基因的扩增、基因的同源性分析以及致病性试验，成功从肾脏、脾脏以及关节积液中分离到8株绿色气球菌，但是该菌并未引起正常健康小鼠的发病或死亡，说明该菌为条件致病性细菌，未发病的原因可能与机体的免疫状态和环境条件有关。目前，绿色气球菌感染猪的发病机理尚不清楚，需进一步研究。猪场应做好防护工作，加强饲养管理，控制环境卫生，切断绿色气球菌的感染途径。

表3 9株绿色气球菌参考菌株的名称与来源