多孔金属支架组织学标本体内体外的切片及染色方法

李静 孙立国 吕荣 赵成相 吴拮（通讯作者）

（空军军医大学西京医院骨科研究所 陕西 西安 710032）

目前病理学对组织切片染色要求越来越高，不脱钙骨、陶瓷材料、金属组织用塑料包埋切片染色已经应用广泛。而金属支架上培养细胞，目前在文献上报道用电镜扫描能观察到细胞核，经我室实验研究得出，用Leica1600型锯式切片机切片，其厚度为200～300μm，经过磨片厚度为50μm用HE染色，结果支架间成骨细胞清晰。用静态培养的细胞支架复合物植到动物体内，组织经切片磨片后，用Van Gieson（V-G）染色法染色，结果支架内成骨和类骨质明显。

1.材料与方法

1.1 取材

支架材料由西南交通大学材料学院制备，制造基本原理是用快速成形对金属直接制造技术以及电子束融化成型技术制备而成。一部分支架用于体外，将配制好的2ml细胞悬液，每隔5分钟滴于支架组织上，滴完为止，用静态培养1d、7d、14d，PBS液冲洗；另一部分把7d的细胞支架复合物植到动物（兔）体内，4、8、12、16W分别取材，用10%福尔马林固定后，流水冲洗半小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明。

组织经塑料I液、Ⅱ液、Ⅲ液分别浸润5～7d。包埋液包埋。贴上标签，将玻璃瓶放入抽真空泵内抽5h以上，玻璃瓶加盖，放入48℃水浴锅内聚合，完全凝固后，将玻璃瓶放入-20℃冰箱内15min，拿出将玻璃瓶砸碎即可。

1.2 切片

用莱卡1600型切片机切片，切片200～250μm厚，再用砂纸将有机载玻片一面的边缘打磨成2厘米毛边，然后用1～2滴502胶水滴于载玻片另一面2/3处粘片，并轻压切片，以免产生气泡，待胶干透，方可麿片。

1.3 磨片

用千分尺测量磨片前厚度，用1500#砂纸放在骨组织试样研麿机上麿片，边磨边加凉水，以免产生高温损伤组织。然后在抛光机上加抛光膏抛光。显微镜观察切片光亮且无划痕，千分尺监测量厚度，最终厚度为30～50μm。

1.4 染色

1.4.1 HE染色法 切片磨片抛光厚度为50μm，将切片放入苏木精染液加热至60℃ 2.5小时，水洗5分钟，用1%盐酸乙醇分化15秒，水洗2分钟，稀氨水返蓝1分钟，水洗2分钟，用80%乙醇脱水1分钟，伊红染色2分钟，水洗2分钟， 晾干即可。

1.4.2 Van Gieson（V-G）染色法 切片磨片抛光厚度为50μm，超声洗片3分钟，流水冲洗3分钟，滴加0.1%甲酸3分钟，流水冲洗3分钟，滴加20%甲醇2分钟，流水洗涤2分钟，恒温60℃下Stevenol蓝染色3分钟，60℃蒸馏水洗涤1分钟，擦干，室温下苦味酸—品红染色15分钟，水洗，晾干即可。

2.结果

多孔金属支架组织经塑料包埋，用Leica1600型锯式切片机切片，其厚度为200～300μm，经过磨片厚度为50μm，用HE染色，结果多孔金属支架深黑色，细胞核蓝色，胞浆红色（图1）。用Van Gieson（V-G）染色法染色，结果多孔金属支架深黑色，胶原纤维绿或青，成骨橙或深红，类骨质黄绿，肌纤维蓝或青（图2）。

图1 HE染色×50

图2 V-G染色×50

3.结论

多孔金属支架组织坚硬，需要通过不脱钙硬组织包埋法，采用Leica 1600型锯式切片机，虽可切出完整的切片，切片厚度200～300μm。但因切片太厚，显微镜下观察，颜色不鲜亮，细胞核较模糊，无法观察到骨细胞核和软骨细胞核，只能采集到低倍的图片，也不能很好区别不同的组织结构。现如今组织形态学的研究对硬组织切片处理要求越来越精细，而现有的切片和染色方法难以满足实验需要。通常用的塑料包埋硬组织切片，虽可切出8μm厚完整切片，但由于钛合金和人工骨材料坚硬，韧性差，一般乌钢刀无法切出完整的切片。

目前在文献上报道用电镜扫描能观察到细胞核，经我室实验研究得出，用Leica1600型锯式切片机切片，其厚度为200～300μm，经过磨片厚度为50μm，用HE染色，结果支架间成骨细胞清晰。用静态培养的细胞支架复合物植到动物体内，组织经切片磨片后，经Van Gieson（V-G）染色法染色，结果支架内成骨和类骨质明显。同时对多孔金属支架组织形态学计量参数的测量提供了可靠的依据。