HPLC-DAD法建立加味滋膵胶囊指纹图谱研究

冉亚东，原欢欢，禹奇男，彭世陆，蒋燕霞，刘世琪，彭涛，秦少容，董自亮

(太极集团有限公司，重庆 408000)

滋膵饮出自清·张锡纯《医学衷中参西录》，由黄芪、生地黄、山药、山萸肉、生猪胰子组成，具有滋补膵脏、益脾固肾之功效，主治消渴。加味滋膵饮为卿玉玲主任医师在大量临床实践的基础上，去方中猪胰子，加莪术、益母草、丹参、大黄而成。组方具有养阴益气、活血通络的功能，用于治疗气阴两虚、血瘀所致消渴，症见腰膝酸软、口渴喜饮、神疲气短、小便量多浑浊、舌质暗淡、舌苔薄白、脉细无力、糖尿病肾病见上述症状者。本课题组将其开发成生物利用度高、顺应性好、携带方便的现代制剂加味滋膵胶囊。

中药指纹图谱是评价含有多种组分中药复方质量的有效手段，具有专属性、整体性和模糊性等特点，其优点在于尽可能全面地反映复方中的化学成分及其相对比例，保证中药及其制剂的稳定性和可靠性，已得到国内外普遍认可[1-2]。本文参考相关文献[3-4]，通过HPLC-DAD 法首次建立加味滋膵胶囊的指纹图谱，以期控制该复方制剂的质量，为该复方制剂的开发提供参考。

1 仪器及试药

Agilent 1100系列液相色谱仪(Agilent公司)，Agilent色谱工作站；BP211型分析天平；HDM调温电热套金坛市华峰仪器设备有限公司)；DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

黄芪、山茱萸、丹参、山药等药材均购自安徽亳州市场，经太极集团重庆涪陵制药厂有限公司质检中心杨修齐研究员鉴定符合药典要求。

乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余均为分析纯。马钱苷对照品(批号111640-201507，质量分数99.2%)，购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.01%甲酸水；流速：1.0 mL/min；检测波长：278 nm；柱温：27 ℃；进样量：20 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 供试品溶液制备

精密称取加味滋膵胶囊0.25 g，以40 mL水复溶，用95%乙醇调整醇含量至75%，均匀搅拌，静置6 h，离心(20 min，3 000 r·min-1)，用75%乙醇洗涤沉淀2次，离心(20 min，3 000 r·min-1)，合并上清，减压浓缩除去乙醇，将得到的提取物冷冻干燥，得到加味滋膵胶囊指纹图谱样品。

2.3 对照品溶液制备

分别精密称取马钱苷对照品适量，用甲醇溶解，配制成马钱苷浓度为65 μg/mL的溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 指纹图谱专属性检测

精密称定加味滋膵胶囊样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测样品，记录各样品内色谱峰、保留时间、峰面积。分别精密吸取空白溶剂、样品溶液注入HPLC仪中，记录色谱与各标示峰的光谱图。实验结果表明，在该条件下空白无干扰。详见图1、图2。

图1 空白溶剂指纹图谱

图2 样品指纹图谱及光谱识别

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密称取同一批样品(批号：170801)，按照“2.1”项下色谱条件，连续进样5次，记录色谱图。以重现性与分离度均好的11号峰(马钱苷峰)为参照峰(S)，考察胶囊指纹图谱各个共有峰的相对保留时间以及相对峰面积RSD值，结果见表2、表3，由表可知，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.92%，相对峰面积RSD均小于4.36%，精密度良好，表明仪器性能稳定。

表2 指纹图谱精密度相对保留时间结果

表3 指纹图谱精密度相对峰面积结果

2.5.2 重复性试验 精密称取同一批样品(批号：170801)，按照“2.2”项下取供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以重现性、分离度均好的11号峰(马钱苷峰)为参照峰(S)，考察胶囊指纹图谱各个共有峰的相对保留时间以及相对峰面积RSD值，见表4、表5，由表可知，相对保留时间RSD均小于0.47%，相对峰面积RSD均小于8.11%，表明该方法重复性良好。

表4 指纹图谱重复性试验结果

表5 指纹图谱重复性相对峰面积结果

2.5.3 稳定性试验 精密称取同一批样品(批号：170801)，按照“2.1”项下色谱条件，在0、4、5、12、16、20、24 h分别进样，以重现性、分离度均好的11号峰(马钱苷峰)为参照峰(S)，考察胶囊指纹图谱各个共有峰相对保留时间以及相对峰面积RSD，见表6、表7，结果显示，相对保留时间RSD均小于0.82%，相对峰面积RSD均小于9.09%，可判断样品24 h内基本稳定。

表6 指纹图谱稳定性相对保留时间结果

表7 指纹图谱稳定性相对峰面积结果

2.6 指纹图谱共有模式的建立及相似度分析

精密吸取18批加味滋膵胶囊样品，按照“2.2”项下制备供试品溶液，取20 μL注入色谱仪，并记录120 min内的色谱图。

采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件，生成共有模式的对照指纹图谱(图3)，不同批次样品共有色谱峰13个。18批样品的相似度在0.951～0.998之间(S1～S18相似度值分别为0.977、0.994、0.994、0.995、0.992、0.998、0.997、0.990、0.955、0.994、0.951、0.991、0.988、0.997、0.997、0.994、0.997、0.998)，相似度高，符合指纹图谱相关要求。

图3 18批加味滋膵胶囊样品指纹图谱叠加

3 讨论

本实验考察了190～400 nm全波长扫描、全波长扫描提取278 nm、278 nm单波长、全波长扫描提取210 nm、全波长扫描提取207 nm等5种扫描方式，结果从谱峰的分离度上看，278 nm单波长效果较佳，且在该波长下谱峰信息最丰富。故选择278 nm单波长扫描方式。

本实验考察乙腈-0.01%甲酸水；甲醇-0.01%磷酸水；乙腈-0.01%磷酸水；乙腈-水；乙腈-0.1%磷酸水5种不同的流动相,实验结果显示，加入酸可以优化峰形，但随着酸浓度的增加，色谱峰的分离度并没有实质性变化，乙腈-0.01%磷酸水和乙腈-0.01%甲酸水色谱图无明显差异，甲醇-0.01%磷酸水色谱峰较宽，且若想达到较好的分离效果，可能需要较长的分析时间。综合上述分析，最终流动相选择乙腈-0.01%甲酸水。

综上所述，本试验采用HPLC-DAD建立的加味滋膵胶囊指纹图谱，共有峰的相对保留时间稳定；方法学考察表明重复性、稳定性好，精密度均符合要求；采用相似度软件分析样品，计算出的相似度较高。以上实验结果表明本实验建立的方法成熟，各样品批间一致性较好，可用于加味滋膵胶囊的质量控制。