加味丹参饮含药血清对骨髓间充质干细胞增殖及分泌bFGF、VEGF的影响

赵慧杰

(安钢职工总医院药剂科,河南安阳 455004)

心血管疾病在临床上属于一类很常见的疾病，目前其已成为危害人类健康的重大疾病。据资料显示[1]，40岁以上人群中冠心病发病率在4%～7%，并呈逐渐上升趋势，其在心血管疾病中死亡率占50%左右。心肌梗死属于冠心病中较严重的类型，临床疗效不够理想，随着对其研究的深入，其研究方向渐渐转向移植治疗，已有研究显示[2]，心肌细胞移植可以作为治疗重型心肌坏死的替代途径。有研究显示[3]，加味丹参饮能够增强心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)模型大鼠的骨髓干细胞动员作用。也有文献报道[4]，丹参、黄芪含药血清能够促进骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)增殖，本研究在此基础上观察加味丹参饮含药血清对BMSCs增值率、分泌碱性成纤维生长因子(bFGF)及血管内皮生长因子(VEGF)的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及仪器

Wistar大鼠均为健康雄性，SPF级，平均体质量(235±25)g；SD大鼠32只，平均体质量(255±15)g，平均周龄(12±1.3)周。购自南京正大天晴公司，动物合格证号：SYXK(苏)2013-0018。

细胞培养箱、细胞计数板、全自动酶标仪分别由美国Shellab、Corning Costar、Bio-Rad公司提供；倒置相差显微镜由日本Olmpus公司提供；小型摇床由德国IKA公司提供。

1.2 溶液配制及试剂

加味丹参饮组方：丹参20 g、赤芍10 g、当归10 g、川芎10 g、红花5 g、黄芪25 g、檀香5 g、生地15 g。将药材混合浸泡后去渣，用水煎煮浓缩至1g/mL(含生药)，保存备用。药液由安钢总医院制剂室提供。

含药血清制备：取SD大鼠32只，随机分为A、B、C、D 4组(n=8)。根据《药理实验方法学》中的动物、人体剂量折算系数表(根据成人最小剂量、常用剂量、最大剂量进行折算)[4]，分别给予A、B、C组大鼠小剂量[5 g/(kg·d)]、常用量[10 g/(kg·d)]及最大剂量[15 g/(kg·d)]的加味丹参饮灌胃，连用5天，D组给予等量的生理盐水灌胃5天。均第1天/1次。腹主动脉取血，离心10 min(3 000 rpm)，吸出上部血清，即得不同浓度加味丹参饮含药血清及空白血清，保存于- 20℃的冰箱中备用。

青/链霉素双抗(GBICO/BRL)、IMDM培养基(GBICO/BRL)、胎牛血清(FBS，由奥地利PAA提供)、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma)、大鼠bFGF、VEGF ELISA试剂盒由武汉博士德提供；MTT由美国Amersco提供。

1.3 方法

首先进行BMSCs分离、培养、传代。具体方法：颈椎脱臼将Wistar大鼠处死，用乙醇(75%)浸泡5 min，分层剥离(在无菌条件下)后肢皮肤及附着上面的肌肉，剪断股骨、胫骨的骨骺端，用IMDM(含胎牛血清10%)培养液冲洗髓腔，过滤(用200钼筛网)，计数板计数，接种(5×106个/mL)，在CO2培养箱(37 ℃)中温育。原代BMSDs培养每3天进行1次换液，细胞接近80%(7～10天)铺满瓶底，用胰蛋白酶(浓度25%)、乙二胺四乙酸(EDTA，浓度0.02%)消化细胞，然后用5×105个/mL细胞接种在传代培养瓶中扩增培养，本实验选用第3代MSCs做研究。

加味丹参饮含药血清对BMSCs增殖的影响。取对数生长期BMSCs(第3代)用胰蛋白酶(浓度25%)、EDTA(浓度0.02%)消化，并在倒置的显微镜下进行观察，细胞略变圆时加入BMSCs完全培养基以终止消化，并用吸管轻轻吹打，细胞浓度调整至1.0×104个/mL，以每孔200 μL接种于4孔板内。将每个培养板上接种的细胞也分为4组：加味丹参饮含药血清小剂量组、中剂量组、大剂量组、空白对照组，每组均8个复孔。培养板分别在培养第1天、第2天、第3天后取出，将孔中培养液吸弃。加味丹参饮含药血清组的孔中分别加入不同浓度加味丹参饮含药血清BMSCs培养基，每孔为200 μL。而空白对照组每孔加入BMSCs完全培养基200 μL。培养板均在24 h后取出，然后每孔均加入MTT溶液20 μL，然后继续孵育4 h后终止孵育，将孔中培养液吸弃，每孔中加入DMSO150 μL，振荡10 min。最后检测490 nm处的光吸收值(用全自动酶标仪)，每板均重复2次，以平均值进行对比分析。

加味丹参饮含药血清对BMSCs分泌bFGF、VEGF的影响。取5×105个/mL细胞接种于4孔板内，均每孔接种1 mL，接种6个培养板。培养板在5%CO2培养箱中(湿度100%，37 ℃)培养第1天，将培养板取出，吸弃孔中的培养液，然后用PBS将每孔清洗3次，并将孔中PBS吸弃。根据不同组别加入不同浓度的加味丹参饮含药血清及完全培养基，培养板置入5%CO2培养箱中(湿度100%，37 ℃)培养，并在第1天、第2天、第3天时取出培养板2块，将培养上清吸至不同EP管中，离心10 min(1 500 r/min)，收集上清，在-80 ℃条件下储存备用。第1天、第2天的样品根据1∶2的比例稀释后检测；第3天的样品根据1∶10的比例稀释后检测。每次均检测3次，取平均值。其余操作均严格根据试剂盒中的说明书进行。用全自动酶标仪对各孔光吸收值进行检测。参考波长为630 nm，扫描波长为450 nm。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 加味丹参饮含药血清对BMSCs增殖的影响

各组BMSCs增殖均随诱导时间增加而增强，第2天、第3天时分别与第1天时两两比较，P<0.01；诱导第1天时，加味丹参饮含药血清各组均不能促进BMSCs增殖，中、大剂量组与空白对照组比较，均明显降低，P<0.01；诱导第2天、第3天时，加味丹参饮含药血清中、大剂量组BMSCs增殖均明显高于空白对照组，P<0.01。见表1。

组别剂量[g/(kg·d)]第1天第2天第3天空白对照组-0.20±0.0180.39±0.015a0.43±0.041a小剂量组50.19±0.0160.38±0.017a0.44±0.042a中剂量组100.17±0.015b0.64±0.014ab0.69±0.021ab大剂量组150.15±0.017b0.70±0.020ab0.74±0.022ab

注：与第1天时比较，aP<0.01；与空白对照组比较，bP<0.01。

2.2 加味丹参饮含药血清对BMSCs分泌bFGF的影响

各组BMSCs分泌bFGF随时间的增加而增加，第2天、第3天时分别与第1天时两两比较，P<0.01；在诱导第1天时，加味丹参饮含药血清各组bFGF的分泌均未增加，小剂量组与空白对照组比较，明显降低，P<0.01；诱导第2天、第3天时，加味丹参饮含药血清中、大剂量组bFGF的分泌均明显高于空白对照组，P<0.01。见表2。

组别剂量(g/kg·d)第1天第2天第3天空白对照组-329.15±11.181 068.75±22.35a2 501.28±42.51a小剂量组5187.17±12.06b952.38±12.47a2 308.47±13.42a中剂量组10290.65±15.011 690.01±21.24ab3 515.75±22.45ab大剂量组15356.72±13.271 791.70±11.39ab3 681.16±35.23ab

注：与第1天时比较，aP<0.01；与空白对照组比较，bP<0.01。

2.3 加味丹参饮含药血清对BMSCs分泌VEGF的影响

各组VEGF分泌随时间的增加而增加，诱导第2天、第3天时分别与第1天时两两比较，P<0.01；诱导第1天时，加味丹参饮含药血清各组VEGF的分泌均未增加，小剂量组与空白对照组比较，还明显降低，P<0.01；诱导第2天、第3天时，加味丹参饮含药血清中、大剂量组VEGF的分泌均明显高于空白对照组，P<0.01。见表3。

组别剂量[g/(kg·d)]第1天第2天第3天空白对照组-719.05±12.17975.28±24.62a2228.54±64.24a小剂量组5481.02±11.45b946.52±13.28a2215.54±58.51a中剂量组10741.38±10.631379.21±11.37ab2608.47±19.48ab大剂量组15756.91±10.721435.70±13.38ab2681.27±22.67ab

注：与第1天时比较，aP<0.01；与空白对照组比较，bP<0.01。

3 讨论

bFGF为一种促血管生长因子，其在体内外均有较强的促细胞增殖能力，VEGF则主要作用于血管形成的早期，主要促使原始血管形成。研究证实[4]，冠心病患者的冠状动脉有狭窄时，缺血心肌的bFGF及VEGF等血管生长因子会明显增加，与其相关的受体也会明显上调，形成自发性新生血管，成立侧支循环。但一般情况下，这种内生性促血管生长因子的增多并不能建立丰富的侧支循环以满足代偿性血液供应，导致心肌缺血情况改善不明显。如果促进血管生长因子分泌，上调相关受体，则有可能增加新生血管生长的数量及生长速度，尽快建立有效侧支循环，以满足心脏血液供应。研究证实[5-6]，BMSCs具有多分化潜能，也具有很大旁分泌及趋化功能，其能够释放多种细胞因子，以促进血管新生，由此，BMSCs移植在冠心病的治疗中广泛应用。

加味丹参饮由丹参、川芎、红花、檀香等多种药物组成，本方以丹参为君药，用于活血化瘀，以黄芪、红花、川芎等养血行气，并加强活血化瘀的作用[7-8]；檀香则为佐药，以行气止痛。其在BMSCs移植治疗中，能明显改善微循环，增加冠脉的血流量，促进侧支循环的建成，并使血液重新分布于心肌，使缺血心肌得到保护。本研究结果显示，加味丹参饮含药血清在诱导第1天时未能使BMSCs增殖增加，反而较空白对照组有所降低，这可能因细胞对外来药物有一定的适应期所致。但在诱导第2天、第3天时，中、大剂量组BMSCs增殖率明显增加，分泌bFGF及VEGF明显增高，且其随时间的增加而有所增强。由此说明剂量为10 g/(kg·d)、15 g/(kg·d)的加味丹参饮血清能促进BMSCs增殖，并能促进BMSCs分泌bFGF及VEGF。此结果与李鑫辉等[9]的研究一致，这可能是因加味丹参饮含药血清能促进BMSCs的旁分泌有关[10]。对于加味丹参饮作用于BMSCs的作用机制，仍需进一步研究。

综上所述，剂量为10 g/(kg·d)、15 g/(kg·d)的加味丹参饮含药血清能促进BMSCs增殖，并能促进BMSCs分泌bFGF、VEGF。