氨磷汀提高人食管癌细胞对顺铂的敏感性

刘华松 徐兰兰

(1十堰市太和医院湖北医药学院附属太和医院胸心大血管外科，湖北 十堰 442000；2湖北医药学院)

食管癌是常见的恶性实体肿瘤，由于容易对化疗药物产生耐药而导致治疗效果差〔1〕。顺铂是治疗食管癌的一线化疗药，其主要作用是导致细胞DNA损伤和氧化应激，然而随着化疗周期的增加肿瘤细胞通过增强DNA修复能力和对顺铂的生物转化增强而对顺铂产生耐药〔2〕。因此，寻找提高肿瘤细胞化疗药物敏感性的临床化疗佐剂成为研究热点。氨磷汀是一种广谱细胞保护剂，既能降低甚至消除化疗药物的毒副作用，又不降低药物疗效，在临床上已经作为一些肿瘤化疗的佐剂，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性〔3，4〕。目前尚未见到氨磷汀对顺铂耐药的人食管癌细胞化疗敏感性影响的相关报道。本文体外研究氨磷汀对人食管癌细胞株ECA109顺铂敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人食管癌细胞株ECA109本室保存。氨磷汀、顺铂(美国Sigma公司)；RPMI1640(美国Gibco公司)，B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、多药耐药关联蛋白(MRP)1抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2实验分组 ①对照组：未进行药物处理；②顺铂组：在培养液中加入2.0 mg/L顺铂；③氨磷汀组：在培养液中分别加入0、5、10、20 μg/ml的氨磷汀；④联合组：在培养液中加入2.0 mg/L顺铂和10 μg/ml的氨磷汀。其中氨磷汀组，分别于培养24、48和72 h收集细胞进行检测；其他各组于培养48 h后收集细胞进行检测。

1.3四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖活性 取生长状态良好的细胞以7×103/200 μl的密度接种于96孔培养板各孔内，空白对照孔仅加入200 μl完全培养液。按照上述分组情况在不同时间点收集细胞进行检测，各体系均设6个平行孔。测量前，每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT溶液各20 μl，继续培养4 h后去掉培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)轻摇混匀10 min至结晶溶解，用酶标仪在490 nm波长处测定吸光度(OD)值，计算细胞存活率和半数抑制浓度(IC50)，实验重复3次。

1.4流式细胞术检测各组细胞凋亡率和细胞周期 收集四组ECA109细胞，其中氨磷汀组只选取10 μg/ml浓度组，各组均在培养48 h后制成细胞悬液，以105/ml的浓度接种于6孔板中，每组均设3个复孔，各组反应体系为2 ml，培养24 h后收集细胞离心后与Annexin V及碘化丙啶(PI)作用15 min，流式细胞仪上检测细胞周期和凋亡率，计算增殖指数。

1.5Western印迹检测耐药蛋白与凋亡蛋白的表达 取对照组、顺铂组、氨磷汀(10 μg/ml)组和联合组细胞，培养48 h后提取全细胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离和转膜，封闭后加入一抗Bcl-2、Bax、MRP1和β-actin，4 ℃过夜，次日滴加二抗(1∶1 000)37 ℃避光孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，用Odyssey扫描系统进行检测及灰度分析，以β-actin为内参，用目标蛋白条带与β-actin条带的灰度比值表示蛋白的相对表达量。

1.6统计学分析 应用SPSS22.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1氨磷汀对ECA109细胞增殖抑制率的影响 与对照组比较，随着氨磷汀作用浓度的升高和作用时间的延长，细胞增殖活性未见明显改变(P>0.05)，见表1。

表1 氨磷汀对培养不同时间点ECA109细胞增殖抑制率的影响

2.2氨磷汀与顺铂联合应用对ECA109细胞增殖活性的影响 与对照组(A值：1.001±0.001)和氨磷汀组(A值：0.997±0.002)、顺铂组(A值：0.519±0.052)比较，联合组可显著降低细胞增殖活性(A值：0.283±0.036，均P<0.01)。

2.3氨磷汀与顺铂联合应用对ECA109细胞凋亡和细胞周期的影响 与对照组比较，联合组细胞G0/G1期和凋亡率明显升高(P<0.01)，增殖指数、S期和G2/M期明显降低(P<0.01)；与顺铂组比较，联合组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)，增殖指数、S期和G2/M期明显降低(P<0.01)；对照组、顺铂组和氨磷汀组G0/G1期、S期和G2/M期、增殖指数和凋亡率无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 氨磷汀与顺铂联合应用对ECA109细胞凋亡率和细胞周期的影响

与对照组比较：1)P<0.01；与顺铂组比较：2)P<0.01；与氨磷汀组比较：3)P<0.01，下表同

2.4氨磷汀与顺铂联合应用对ECA109细胞耐药相关蛋白与凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组和顺铂组比较，联合组细胞内Bcl-2和MRP1蛋白的表达明显降低(P<0.05)；氨磷汀组细胞内MRP1明显降低(P<0.05)，见图2，表3。

图2 氨磷汀联合顺铂对ECA109细胞Bcl-2、Bax和MRP1蛋白表达的影响

组别Bcl-2BaxMRP1对照组0.623±0.0190.430±0.0130.386±0.011顺铂组0.304±0.0120.452±0.0180.127±0.008氨磷汀组0.589±0.0170.461±0.0200.408±0.014联合组0.117±0.0091)2)3)0.455±0.0160.051±0.0021)2)3)

3 讨 论

氨磷汀是第一个被国际上广泛认可的细胞保护剂，在临床上用于减轻放疗引起的副作用〔5〕。研究还发现氨磷汀与化疗药物联合应用，可以减轻化疗药物的全身毒性作用，提高化疗剂量与强度，从而提高化疗药物的临床疗效〔6～8〕。

化疗是恶性肿瘤综合治疗中的主要方法之一，疗效降低的主要问题是对正常细胞的损伤和耐药的发生〔9〕。逐渐兴起的细胞保护剂主要用来预防和减轻放化疗引起的正常组织细胞的毒性作用，提高患者的耐受性与顺应性，从而提高化疗效果和患者生活质量〔10〕。有研究表明氨磷汀主要分布在正常组织细胞内，极少分布于肿瘤组织内，在不影响化疗药物抗肿瘤活性的同时选择性地保护正常组织，甚至在一些临床研究中发现氨磷汀发挥化疗增敏作用〔11～13〕。本研究结果说明氨磷汀可能对细胞的增殖有一定抑制作用，至少氨磷汀不会对ECA109细胞产生细胞保护作用，此结果与王根菊等〔14〕的结果研究一致。

食管癌是发生于食管黏膜上皮组织的恶性度较高的肿瘤，临床上仍以手术前化疗结合术后辅助化疗为主要手段改善食管癌患者的长期生存率〔15〕。目前，顺铂是治疗进展期食管鳞癌的常用药物，但高剂量重复用药往往引起全身多器官系统的损伤和耐药，很大程度上限制了顺铂的应用〔16〕。因此，提高食管癌细胞对顺铂的敏感性并降低顺铂的毒副作用成为临床化学药物治疗食管癌的主要策略。本研究结果表明氨磷汀可能并不直接导致ECA109细胞增殖抑制或凋亡。同时，氨磷汀与顺铂联合应用组细胞的凋亡率却较顺铂组明显增加，说明氨磷汀可以提高ECA109细胞对顺铂的敏感性。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，二者发挥协同作用，共同调节细胞凋亡，通常用Bcl-2/Bax 在细胞内表达的比值来判断凋亡过程是否是Bcl-2蛋白介导的〔17〕。本研究结果表明氨磷汀与顺铂联合应用可以诱导更显著的细胞凋亡。

肿瘤细胞的重要特征是持续分裂增殖，细胞的增殖通过细胞周期实现〔18〕。细胞周期包括S期与M期两个功能阶段和G1期与G2期两个准备阶段，各期的细胞内DNA含量不同，以此检测细胞的增殖活性〔19〕。本研究结果表明氨磷汀与顺铂联合应用阻止细胞DNA复制，抑制细胞增殖，与细胞凋亡结果一致。MRP1是食管癌发生耐药的相关耐药蛋白，本研究结果显示，氨磷汀与顺铂联合应用可以明显降低ECA109细胞MRP1的表达，同时，氨磷汀单纯用药组也能降低MRP1蛋白的表达，表明氨磷汀可以提高食管癌细胞的化疗敏感性。

综上所述，本研究证实，氨磷汀虽然不具有明显的抑制食管癌细胞增殖的作用，但可提高食管癌细胞对顺铂的化疗敏感性。