CDR1as在喉鳞状细胞癌中的作用机制研究

张建中，赵耀新，胡华勇，王燕玲，黄海琼，蔡刚

(广州医科大学附属第五医院耳鼻喉科，广东 广州 510700)

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是仅次于肺癌的常见呼吸道恶性肿瘤，其发病率逐年增长，2016年约13 430例新发喉癌被确诊、3 620例患者死亡[1]。近年来浸润性LSCC患者5年生存率反而从66%减少至63%，可能与缺乏明确的诊断、术后局部及区域性复发、保喉治疗(包括放化疗)增多及相关的放化疗抵抗有关[2-3]，进一步明确LSCC发病潜在的分子机制、寻找更有效的治疗方法成为临床研究的热点。

真核细胞中转录生成的RNA中，95%为非编码RNA，包括短链微RNA、长链非编码RNA和环状RNA[4]。环状RNA是最近在哺乳动物中发现的内源性非编码、高度保守、以共价环存在的RNA分子，具有基因调节作用。小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as)是最近发现的一种环状RNA，其在胰腺细胞内过表达可显著促进胰岛素合成与分泌[5]，动物脑组织中CDR1as表达不足或缺乏可导致感知能力损害[6]，CDR1as也被证实在胃癌、结直肠癌和肝癌细胞中过表达[7-9]。我们前期研究发现CDR1as在LSCC细胞中高表达，认为其高表达是判断预后不良的指标之一。本研究探讨上调和敲除CDR1as对LSCC细胞的影响，分析其与微RNA-7(microRNA-7，miR-7)表达的关系及其在LSCC发病中的作用机制，为寻找新的治疗途径和靶点提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

TRIzol试剂、脂质体2000、RPMI 1640培养基、胎牛血清、CCK-8试剂盒、反转录试剂盒(广州维伯鑫)。人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2和AMC-HN-8均购自中国科技大学细胞库，细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔日换液。

1.2 细胞转染及分组

由广州莱博生物科技有限公司合成miR-7 mimics及CDR1as-shRNA。Hep-2和AMC-HN-8细胞接种于12孔培养板，分别转染空白及携带CDR1as、CDR1as-shRNA、miR-7 mimic脂质体2000，均严格按说明书操作。将细胞分为空白对照组(Ⅰ组)、CDR1as组(Ⅱ组)、空转染对照组(Ⅲ组)、转染CDR1as-shRNA组(Ⅳ组)，检测CDR1as对Hep-2和AMC-HN-8细胞的作用。检测CDR1as调节miR-7靶基因及蛋白作用的实验中，细胞分为4组，分别为空白对照组(Ⅰ组)、转染miR-7 mimics组(Ⅱ组)、转染CDR1as组(Ⅲ组)、转染CDR1as+miR-7 mimics组(Ⅳ组)。

1.3 细胞活性检测

转染的细胞系培养成熟后，使用PBS冲洗，按CCK-8试剂盒说明书操作，酶标记法测量450 nm波长吸光度值分析细胞活性。

1.4 克隆形成检测

收获过表达CDR1as或(和)miR-7的细胞系，重悬于含10%胎牛血清的完全培养基中，然后接种于12孔板中培养10 d，0.1%结晶紫染色，甲醇处理15 min，荧光显微镜下观察，记录大于50个细胞的克隆细胞集落。

1.5 细胞凋亡检测

细胞使用碘化丙啶染色，37 ℃避光保存30 min后检测细胞周期。-20 ℃条件下70%乙醇处理细胞2 h后进行细胞凋亡检测。加入10 mg/mL核糖核酸酶，按照说明书操作，用2 μL annexin V和2 μL碘化丙啶染色，流式细胞术进行检测。

1.6 迁徙和侵袭能力检测

采用Transwell实验检测细胞迁徙和侵袭能力。将转染CDR1as或(和)miR-7的细胞加到无被覆Transwell小室的上室中检测细胞侵袭。发生迁徙和侵袭的肿瘤细胞被基底膜基质覆盖，未发生迁移和侵袭的细胞用棉签移除，结晶紫染色，显微镜下随机选择5个视野进行细胞计数。

1.7 免疫印迹

使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离提取的细胞总蛋白，将蛋白带转移到硝化纤维膜上，室温下TBST液中以5%脱脂牛奶封闭1 h。以GAPDH作为内参照，加入特异性一抗室温孵育过夜，TBST液充分洗膜，加入HRP交联二抗室温孵育1 h，TBST液冲洗，加入ECL发光液显影。

1.8 实时定量PCR

按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒反转录生成cRNA。以GAPDH为内参照，实时定量PCR检测CDR1as、miR-7、细胞周期蛋白E1(CCNE1)、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ(PIK3CD) mRNA表达。引物序列：CDR1as上游引物5′-TAGTACGTCGTGCCCTGA-3′，下游引物5′-CACTTGACGTGCAGCATC-3′； miR-7上游引物5′-CCACGTTGGAAGACTAGTGATTT-3′，下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′； CCNE1上游引物5′-ATGAAGAAGTTGAACCATGCCA-3′，下游引物5′-CCTCCAGAACAGTATTCCATTGC-3′； PIK3CD上游引物5′-AAGGAGGAGAATCAGAGCGTT-3′，下游引物5′-GAAGAGCGGCTCATACTGGG-3′；GAPDH上游引物5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，下游引物5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′。PCR扩增步骤：95 ℃ 10 s，94 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。实验重复3次，用2-△△Ct法计算目的基因的表达量。

1.9 荧光免疫组织化学

参照文献[10]采用荧光免疫组织化学检测各组细胞CCNE1和PIK3CD蛋白表达，以Ki-67表达为阳性对照。

1.10 统计分析

采用SPSS 16.0软件分析处理数据。两组数据组间比较用t检验或U检验，多组数据组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDR1as mRNA表达检测

实时定量PCR显示，与空白对照组比较，转染CDR1as后Hep-2和AMC-HN-8细胞CDR1as mRNA表达均显著增加，而转染CDR1as-shRNA后CDR1as mRNA表达均显著降低(均P<0.01)。见图1。显示Hep-2和AMC-HN-8细胞过表达和敲除CDR1as基因模型构建成功。

注：组间比较，**P<0.01，***P<0.001

图1 转染CDR1as、CDR1as-shRNA后两种细胞系CDR1as mRNA表达检测(实时定量PCR)

2.2 细胞活性检测

与对照组相比，转染CDR1as后两种细胞系细胞活性均明显增加；与空染组相比，转染CDR1as-shRNA后两种细胞系细胞活性均明显降低(均P<0.05)；而空染组与对照组相比细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。显示过表达CDR1as可增加肿瘤细胞活性，敲除CDR1as后细胞活性明显降低。

注：组间比较，*P<0.05,**P<0.01

图2 转染CDR1as、NC-shRNA、CDR1as-shRNA后两种细胞系细胞活性检测(CCK-8法)

2.3 细胞分化和细胞集落形成检测

转染CDR1as后两种细胞系细胞分化及细胞集落形成均明显增加，而转染CDR1as-shRNA后细胞分化及细胞集落形成均明显受到抑制(均P<0.01)。见图3，图4。显示过表达CDR1as导致细胞分化增加、细胞集落形成增多，而敲除CDR1as后上述作用被抑制。

2.4 细胞周期和细胞凋亡检测

转染CDR1as后两种细胞系细胞停留于S期，细胞合成、分裂能力增强；而转染CDR1as-shRNA后细胞停留在G0/G1期，诱导凋亡(均P<0.01)。见图5。显示过表达CDR1as能促进细胞增殖，敲除CDR1as后导致细胞停留在G0/G1期并诱导细胞凋亡。

注：组间比较，**P<0.01

图3 转染CDR1as、NC-shRNA、CDR1as-shRNA后两种细胞系细胞分化检测(流式细胞术)

注：组间比较，**P<0.01

图4 转染CDR1as、NC-shRNA、CDR1as-shRNA后两种细胞系细胞集落形成检测

2.5 细胞迁徙和侵袭能力检测

Transwell实验显示，与对照组比较，转染CDR1as后两种细胞系的细胞迁徙和侵袭能力增强，而转染CDR1as-shRNA后细胞迁徙和侵袭能力减弱(均P<0.01)。见图6。即CDR1as过表达能增加细胞迁徙和侵袭能力。

2.6 CDR1as调节miR-7的靶基因及蛋白表达检测

空白对照组CCNE1和PIK3CD基因及蛋白均有表达，转染miR-7 mimics后两者表达显著降低，而转染CDR1as后两者表达显著增加，证实miR-7的靶基因CCNE1和PIK3CD均能被CDR1as调节；而同时转染CDR1as+miR-7 mimics组与转染CDR1as组之间上述两种蛋白表达有显著差异，表明miR-7表达恢复可抵消CDR1as调节LSCC的过程并抑制CCNE1和PIK3CD表达。见图7。说明CDR1as诱导LSCC是通过调节miR-7/CCNE1/PIK3CD轴而发挥作用。

3 讨论

尽管通过手术、放疗及生物免疫治疗等综合手段，LSCC患者特别是晚期患者总体生存率在过去十几年并没有得到显著提高[1]，表明LSCC发生的分子机制还有待进一步认识。癌症基因组图谱研究显示在LSCC中存在EGFR、ERBB2、CCND1、TP53、PIK3CD等多个潜在的治疗靶点，在肿瘤形成过程中CDR1as上调可以通过EGFR/RAF1/MAPK或PTEN/PI3K/AKT信号通路而减弱具有肿瘤抑制作用的miR-7的功能而发挥致癌基因作用[10]。

与线性RNA不同，环状RNA的3，和5，端通过共价键连接形成环形结构，这可阻止其被RNA核酸外切酶降解，保证其结构稳定性并使其大量表达于真核细胞质中。环状RNA具有保守性、丰富性及组织特异性，发挥肿瘤调节作用，并作为肿瘤特异性的分子标记物[11]。研究证实环状RNA可竞争内生性微RNA(miRNA)或作为miRNA海绵体在多种生物过程及疾病的发生、发展中发挥基因调节作用。研究显示，环状RNA在LSCC中存在表达失衡现象，其中hsa_circRNA_100855上调最明显、hsa_circRNA_104912下调最显著，表明环状RNA在LSCC发生、发展及预后方面起着重要作用[12]。本研究中培养两种细胞系Hep-2和AMC-HN-8，通过过表达与敲除两个相反的方向给予实验干预，观察细胞活性、生长速度、凋亡、迁徙及侵袭能力，发现CDR1as过表达导致细胞生长旺盛、细胞凋亡减少、迁徙和侵袭能力增强，而敲除CDR1as后细胞上述表现则相反，从而认为CDR1as在LSCC中为促癌基因。

注：A：细胞周期检测；B：细胞凋亡检测；组间比较，**P<0.01

注：组间比较，**P<0.01

注：A：4组Hep-2细胞CCNE1和PIK3CD mRNA表达(PCR)；B：4组Hep-2细胞CCNE1和PIK3CD蛋白表达(荧光免疫组织化学)；C：4组AMC-HN-8细胞CCNE1和PIK3CD mRNA表达(PCR)；D：4组AMC-HN-8细胞CCNE1和PIK3CD蛋白表达(荧光免疫组织化学)；组间比较，**P<0.01

图7 CDR1as调节两种细胞系的miR-7靶基因及蛋白表达检测

环状RNA因为其环形结构包含miRNA结合位点，即miRNA反应元件，这些元件发挥着海绵体作用。在高表达CDR1as的肝癌细胞中敲除CDR1as基因后， miR-7表达上调、CCNE1和PIK3CD基因表达下调，其肿瘤分化及侵袭被抑制[13]。结直肠癌的体内实验显示，CDR1as可通过阻止miR-7的肿瘤抑制作用而促进肿瘤生长；敲除CDR1as后结直肠癌细胞的分化及侵袭受到抑制，而转染miR-7抑制剂可恢复CDR1as被敲除的功能[6]。本研究中，我们发现转染miR-7 mimics，可促进肿瘤生长和侵袭的基因CCNE1和PIK3CD低表达，转染CDR1as后两者高表达，同时转染CDR1as+miR-7 mimics导致两者表达降低，表明CDR1as通过调节CCNE1和PIK3CD促进肿瘤生长和侵袭，这种作用可被miR-7所抵消。本研究证实在LSCC细胞中，CDR1as通过miR-7信号通路促进肿瘤发生、增殖、迁延及侵袭。

综上述，本研究发现CDR1as可通过miR-7/CCNE1/PIK3CD信号通路促进LSCC的发生、发展和转移，CDR1as可能成为LSCC的一项新的生物标记物和潜在的治疗靶点。