甲状旁腺激素对双足鼠脊柱侧凸进展的影响

陆凌云，戴哲浩，吕国华，潘越(.厦门市第五医院骨科，厦门大学附属第一医院同民分院，福建 厦门 360；.中南大学湘雅二医院脊柱外科，湖南 长沙 400)

特发性脊柱侧凸(Idiopathic Scoliosis，IS)发病机制复杂，始动因素不明，遗传因素、生长发育不平衡等均被认为与IS发病和进展有关[1]。尽管如此，上述始动因素最终引起的脊柱生物力学异常则被认为是IS进展更为直接的原因[2-3]。主流的治疗方法(佩戴支架和手术矫形)也是旨在借“外力”恢复脊柱力学平衡，而非针对病因治疗。因此，我们设想在脊柱侧凸早期便使用促骨形成药物(甲状旁腺激素，Parathyroid Hormone，PTH)，通过增强“内力”达到控制其进展的目的[4]。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组 雌雄对半的三周龄SD大鼠60只(由中国科学院上海实验动物中心提供，SPF级，NO.430470040)适应性饲养1周，X线摄片确认无脊柱侧弯及其他脊柱畸形，然后依体重轻重编号，采用随机数字表分为三组：双足鼠组、拴系-双足鼠组、PTH干预组。每组20只，雌雄对半。

1.2 动物模型的建立

1.2.1 双足鼠组 按40 mg/kg剂量腹腔内注射1%戊巴比妥钠(上海生工生物有限公司)麻醉大鼠。成功后取俯卧位，切口周围备皮、络合碘消毒。在盂肱关节处做切口，游离皮下，在腋部缝扎上肢神经血管束后，切开盂肱关节并离断，彻底止血后，缝合肌肉、皮肤。随后在尾巴根部环行切开皮肤，贴近根部进行缝扎后截除尾部，缝合皮肤。

1.2.2 拴系-双足鼠组 麻醉成功后，在左肩胛下角处，横行切开皮肤及皮下，长约0.5 cm，钝性分离肌肉，显露肩胛下角。再在骨盆髂冀水平，横行切开皮肤及皮下，长约2 cm，显露同侧(左侧)骨盆髂翼，弯钳钝性分离两切口之间皮下组织并测量左侧肩胛下角和同侧骼后上棘之间的距离。缝针带7号丝线贯穿髂后上棘后做“8”字缝合，然后在皮下用小弯钳将结扎在髂后上棘的缝线牵拉到肩胛下角切口处，随后将缝线穿过肩胛下角，调整缝线长度至前述所测距离一致时做“8”字缝扎，止血后缝合皮肤。然后截去双上肢和尾部。造模后8周末，剪断栓系缝线。

1.2.3 PTH干预组 手术处理方式与拴系-双足鼠组一致。从造模后第一天开始，在颈背部行PTH皮下注射，剂量为20 μg/kg·d，连续12周。以每2 mg PTH(上海吉尔生化有限公司)溶于100 mL生理盐水中配置PTH溶液，即每100 g大鼠体重皮下注射0.1 mL液体量。造模后8周末，剪断栓系缝线。

1.2.4 饲养 造模后单只饲养，自由进食进水。根据大鼠的生长情况，逐步抬高水和食物，促使大鼠在尽可能多的时间内保持双足站立或运动状态。

1.3 观察方法 造模后即刻、造模后4周、造模后8周、造模后12周(处死前)拍摄脊柱全长正位X线片，测量Cobb角，评价脊柱侧凸发生和进展情况。麻醉方法为：按40 mg/kg剂量腹腔内注射1%戊巴比妥钠。当Cobb角大于10°时则判定为发生了脊柱侧凸。摄片时，自制固定架将大鼠头部固定，整体抬高与地平线成30°夹角，利用重力对躯干形成一定的牵引，避免麻醉导致的体位性侧凸(见图1)。摄片参数设定为：电流2.80 mAs，电压41 KV，时间0.4 s，焦点距离1 m。

图1 X线检查示意图

完成X线摄片后立即使用双能X线测定骨密度仪(QDR4500A型，美国Hologic公司)扫描大鼠。将大鼠俯卧于扫描台上，下肢尽量外展。仪器自带分析软件测定脊柱的面积BMD。扫描前利用自带小动物体模质控。

在最后一次X线摄片时，记录拴系-双足鼠组和PTH干预组各大鼠的顶椎位置。腹腔内注射过量戊巴比妥处死大鼠，纵行切开背部皮肤、分离肌肉，充分显露脊柱骨性结构，以垂直于顶椎椎板、平行于棘突的方式扎入大头针1枚，在顶椎下一位椎体以同法再扎入1枚大头针，量角器量取两者夹角，即顶椎旋转度。

从脊柱整体中分离拴系-双足鼠组和PTH干预组大鼠的顶椎，双足鼠组则取L1椎体为对照。显微CT(GE Explore Locus SP型) 扫描上述椎体标本。将标本沿长轴垂直放置于仪器自带的固定容器内，以乙醇(70%)为扫描介质并确保介质内无明显气泡。扫描参数设定为管电压80 kV，电流80 μA，360°旋转，扫描时间大约为180 min平均4帧，角度增益0.4°，曝光时间3 000 ms，各向同性分辨率8.0 μm× 8.0 μm× 8.0 μm。以Fluro方式将标本全部选入扫描窗口内，并同时扫描随机自带标准体模。扫描完成后，校正CT值及旋转中心，以41.0 μm× 41.0 μm× 41.0 μm的分辨率重建整体结构。随后，在椎体前后缘中点之间做连线，划分椎体为凹凸两侧，便于分别测量。选取椎弓根上缘与椎体体部交接处为起始平面，向下2.0 mm范围内的区域为感兴趣区域(Region of interest，ROI)，行8.0 μm× 8.0 μm×8.0 μm三维重组，完成图像二值化及ROI内松质骨的三维可视化(见图2)。利用仪器自带分析软件计算ROI内松质骨各参数，包括体积骨密度(volumetric BMD，vBMD)、骨体积分数(bone volume fraction，bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number，Th.N)、骨小梁厚度(trabecular thichness，Tb.Th)、骨小梁间隔(trabecular separation，Th.SP)等。

图2 显微CT椎体松质骨三维可视化

2 结 果

2.1 一般情况 造模后第1天，三组大鼠均少食、少动，切口有少许渗血。造模后第3天，大鼠活动量恢复，饮食如常。造模后第10天，切口愈合。各组均无大鼠死亡。较造模后即刻，造模后4周、8周、12周的双足鼠组体重分别增加了66.87%、140.21%、176.67%，拴系-双足鼠组体重分别增加了71.32%、147.19%、204.21%，干预组体重分别增加了66.04%、137.26%、175.50%，重复测量设计的方差分析结果：a)不同时间点的体重有差别(F=509.992，P=0.000)；b)三组的体重变化趋势无差别(F=2.416，P=0.305，见图3)。

图3 体重变化示意图

2.2 脊柱侧凸情况 X线片检查在双足鼠组中未发现脊柱侧凸、椎体旋转和楔形变(见图4a)；在拴系-双足鼠组和PTH干预组中，大鼠均发生了侧凸(见图4b、4c，见表1)，两组Cobb角资料见表2及图5，采用两因素重复测量设计的方差分析，判断PTH注射随着时间变化对栓系大鼠Cobb角的影响。通过对学生化残差的分析，经Shapiro-Wilk检验，各组数据服从正态分布(P>0.05)；通过学生化残差是否超过±3倍的标准差判断，各组数据无异常值。经Mauchly’s球形假设检验发现其不满足球对称假设(P<0.001)，说明重复测量数据之间存在相关性，因此，对是否使用PTH干预及时间因素进行单独效应的检验。

a 双足鼠组 b 拴系-双足鼠组 c PTH干预组

图4 造模后12周大鼠脊柱X线片

表1 大鼠侧凸情况比较(例)

结果表明：a)在造模后4周、8周、12周，PTH干预组与拴系-双足鼠组的Cobb角的差异具有统计学意义(见表2，图5)；b)在拴系-双足鼠组中时间的单独效应存在4个水平，因变量不符合球形假设(P<0.001)，Greenhouse-Geisser方法计算的Epsilon=0.387，F=259.716(1.161，22.066)，P<0.001，时间因素对于Cobb角的单独效应具有统计学意义，两两比较显示各时间点之间Cobb角的差异具有统计学意义(P<0.001)；c)在PTH干预组中，时间因素不符合球形假设(P<0.001)，Greenhouse-Geisser方法计算的Epsilon=0.420，F=340.919(1.261，23.960)，P<0.001，两两比较显示各时间点之间Cobb角的差异具有统计学意义(P<0.001)。大鼠处死后，测量顶椎旋转度，PTH干预组的顶椎旋转度为(4.4±1.5)°，拴系-双足鼠组为(6.0±2.2)°，采用两独立样本t检验分析，两组之间的差异具有统计学意义(t=2.687；P=0.011)。

2.3 DXA扫描结果 采用重复测量设计的方差分析，判断不同干预方式随着时间变化对大鼠脊柱BMD的影响。通过对学生化残差的分析，经Shapiro-Wilk检验，各组数据服从正态分布(P>0.05)；通过学生化残差是否超过±3倍的标准差判断，各组数据无异常值。经Mauchly’s球形假设检验发现其不满足球对称假设(P<0.001)，说明重复测量数据之间存在相关性(见表3，图6)，因此，对干预方式及时间因素进行单独效应的检验，结果表明：a)各组大鼠的脊柱BMD均随着增龄显著性增加，提示此时期是大鼠的生长期，可作为干预的窗口期；b)造模后即刻(0周)各组大鼠的脊柱BMD之间的差异无统计学意义；c)造模后4周、8周、12周，干预方式对于大鼠脊柱BMD的影响具有统计学意义，两两比较显示：与拴系-双足鼠组和双足鼠组比较，PTH干预组大鼠脊柱BMD显著增高(P<0.001)，而拴系-双足鼠组和双足鼠组之间脊柱BMD的差异无统计学意义(在造模后4周、8周、12周，P值分别为1.000，0.693，1.000)。

2.4 显微CT测定椎体骨微结构参数 大鼠椎体两侧骨微结构的情况见表4。组内椎体(顶椎)两侧各参数比较，采用配对t检验，在双足鼠组，两侧各参数差异无统计学意义(P=0.893)；在拴系-双足鼠组，凹侧的vBMD、BV/TV、Tb.Th高于凸侧，Tb.Sp低于凸侧，而Tb.N差异无统计学意义；在PTH干预组，凹侧BMD、BV/TV、Tb.Th高于凸侧，Tb.Sp低于凸侧，Tb.N差异无统计学意义。组间比较采用单因素方差分析，与双足鼠组比较，拴系-双足鼠组的凸侧BMD(P=0.000)及凹侧BMD、BV/TV、Tb.Th增高(P值分别为0.000；0.000；0.003)，而且凹侧Tb.Sp减小(P=0.000)。与双足鼠组和拴系-双足鼠组对比，PTH干预组大鼠无论是凸侧还是凹侧的BMD、BV/TV、Tb.Th数值均增加，Tb.Sp降低，Tb.N差异无统计学意义。在拴系-双足鼠组，顶椎的凹侧BMD、BV/TV、Tb.Th较凸侧分别高出了7.6%、14.4%、13.9%；在PTH干预组，仅分别高出了6.9%、7.9%、10.5%，三者在凸凹侧的变化程度具有显著差异性(见图7)。

表2 大鼠Cobb角情况比较(°)

表3 不同时期各组大鼠DXA扫描结果比较(mg/cm2)

图5 Cobb角不同时间点变化趋势 图6 骨密度不同时间点变化趋势

3 讨 论

IS病因不明，但是脊柱生物力学异常被认为是导致IS进展最为直接的原因[2-3]。当下的主流治疗方法(佩戴支架和手术矫形)也是旨在借“外力”恢复脊柱力学平衡，以期阻止IS进展，而非针对病因治疗[5]。Machida等[6]发现补充褪黑素可以控制褪黑素水平低下的IS患者的侧凸进展，而褪黑素在体内能发挥积极的抗骨质疏松作用[7]。同时，大量研究证实IS患者存在全身性的BMD降低和骨质量低下[8]。Uchiyama等[9]指出骨小梁BMD与骨弹性模量成正相关，因而IS患者骨弹性模量低下，应力下抗变形能力差，在生长发育过程中容易出现脊柱畸形。这提示我们通过提高脊柱BMD和骨质量，增强“内力”以对抗异常脊柱生物力学，是减缓或阻止IS进展的另一新途径。

表4 各组大鼠椎体两侧骨微结构参数比较

本研究中，与顶椎凸侧比较，凹侧BMD增高、骨小梁增厚且间距缩小，骨小梁更加强韧。与双足鼠组相比，拴系-双足鼠组的凸侧BMD，凹侧BMD、BV/TV、Tb.Th数值增高，且凹侧Tb.Sp缩小，这表明顶椎凹凸两侧均在通过自我调整BMD和骨微结构以匹配各自微环境的变化，其差异是由于凹侧骨小梁增生更活跃导致。我们推测该结果是由于不对称力学因素出现后，凸侧软骨生长板在张应力刺激下提高了骨建造水平，新骨加速形成从而表现出BDM增高及椎体高度增加；而凹侧在压应力的作用下抑制了骨建造活性，导致新骨形成不足。该过程与Hueter-Volkmann定律相符。凹侧成骨不足，不能有效抵抗压应力，骨小梁微骨折、高度进一步丢失、椎体楔形变、侧凸进展，形成“恶性循环”。然而，微骨折会激活骨重建，随着骨重建水平的提高，凹侧变得强韧，在一定程度上打破“恶性循环”的过程、阻碍椎体的楔形变和侧凸的进行性加重，该过程又与沃尔夫定律(骨的结构与功能相匹配)相符。因此，我们观察到凸凹两侧BMD均显著增加的现象。剪断栓系缝线后，Cobb角没有持续增大，可能原因是大鼠此时进入成熟期，生长潜能降低，骨建造作用消退，而凹侧骨重建机制持续性激活，不断重塑凹侧骨小梁，使其强度不断增大，直到足以对抗不对称的力学因素。这合理诠释了侧凸在患者生长高峰期时进展迅猛，而一旦发育成熟、椎体骨骺闭合，其进展的风险便明显下降的现象。

a 双足鼠组椎体冠状位及横断位二维结构，两侧骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间隔无明显差别

b 拴系-双足鼠组椎体冠状位及横断位二维结构，与凸侧比较，凹侧(白色箭头)骨小梁明显增厚、增多，骨小梁间距缩小

c PTH干预组椎体冠状位及横断位二维结构，与拴系-双足鼠组比较，骨小梁明显增厚，骨小梁间距缩小

图7 椎体松质骨二维结构示意图

PTH是目前上市的唯一一种促骨合成药物[10-11]。在本研究中，PTH提高了大鼠脊柱BMD。显微CT的数据进一步表明，PTH改善了顶椎两侧的vBMD和骨微结构，虽然其仍存在显著性差异，但是该差异已较拴系-双足鼠组明显减小。宏观上，PTH干预组大鼠的Cobb角从造模后第4周开始便显著小于拴系-双足鼠组，顶椎旋转度也显著减小。

本研究证实了脊柱侧凸的凹凸两侧在Hueter-Volkmann定律和沃尔夫定律的支配下通过自我调整BMD和骨微结构以顺应各自的微环境改变，而且逐渐提高的骨重建水平增强了凹侧骨骼强度，在某种程度上打破“恶性循环”并阻止脊柱侧凸进展。PTH的应用，提前提高了骨重建水平，增强了“内力”以对抗生物力学异常，从而达到控制侧凸进展的目的。我们的尝试为治疗脊柱侧凸提供了新的思路。