大鼠抗人β-catenin多克隆抗体的制备与鉴定①

牛夏忆 李 淼 张 倩 陈云雨 刘晓平

(皖南医学院药物筛选与评价研究所，芜湖241002)

Wnt/β-catenin信号通路的异常活化在肝癌、乳腺癌、结直肠癌、急慢性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌等多种癌症的发生与发展中发挥重要作用，已成为肿瘤靶向治疗的重要靶标之一[1,2]。β-catenin是经典Wnt信号通路中重要的信号转导效应分子，其核心功能区包括犰狳蛋白重复片段结构域(138-686 aa)蛋白和C端转录激活结构域(687-781 aa)，主要介导与Wnt信号通路其他蛋白相互作用和染色质重塑复合体的募集[3]。在肿瘤细胞内，β-catenin通过与Tcf4(T-cell factor 4)和Lef1(lymphoid enhancer factor 1)相互作用而启动大量原癌基因表达，调控肿瘤细胞的生长、分化、增殖、浸润及转移[4,5]。另外，Spranger等研究发现肿瘤细胞内高表达β-catenin可能是黑色素瘤抵抗免疫治疗的重要机制之一，但β-catenin如何在肿瘤微环境中调控免疫耐受的分子机制尚未明确[6,7]。

本实验旨在利用DNA重组技术进行人β-catenin(138-781 aa)原核表达与分离纯化，并以此为抗原制备特异性大鼠多克隆抗体(Polyclonal antibody,PcAb)，为深入研究β-catenin在肿瘤免疫耐受中的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 GST-β-catenin-pGEX-4T-1重组质粒和pET-30a(+)载体由中国科学院大学存济医学院袁莉教授惠赠；E.coliDH5α及E.coliRosetta (DE3)感受态细胞、Taq酶、DNA标准分子量、pEASY®-T1试剂盒、T4DNA连接酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、蛋白标准分子量、BamHⅠ与XhoⅠ购自全式金公司；二辛可宁酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司；氨苄西林、卡那霉素、异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)购自阿拉丁公司；牛血清白蛋白、小鼠抗组氨酸(Histidine,His)标签单抗、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗小鼠IgG和HRP-山羊抗大鼠IgG购自Biosharp公司；MaxiLuminTM化学发光液购自百智生物公司；四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)溶液购自天根生化科技(北京)有限公司；384孔板购自PerkinElmer公司；异硫氰酸荧光素(Fluoresc-ence isothiocyanate,FITC)标记的Lef1[FITC-Lef1:FITCGDPELCATDEMIPFKDE]由上海强耀生物科技有限公司合成；HisTrapTM层析柱购自GE公司；Freund完全佐剂和Freund不完全佐剂购自Sigma公司；Wistar大鼠购自维通利华公司；其他生化试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 β-catenin(138-781 aa)基因克隆 根据人β-catenin(138-781 aa)基因序列设计引物，上游引物P1：5′-AGGATCCAACTTGATTAACTATCAA-3′；下游引物P2:5′-ACTCGAGCAGGTCAGTATCAAACCA-3′。以GST-β-catenin-pGEX-4T-1质粒为模板扩增β-catenin基因片段。PCR反应条件如下：94℃预变性5 min、94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s、进行30个循环后，72℃总延伸10 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

1.2.2 β-catenin原核表达载体构建 β-catenin基因进行切胶回收后，以pEASY®-T1试剂盒与T载体连接后，转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于LB固体培养基(含100 μg/ml氨苄西林)。37℃培养过夜后，挑取经蓝白斑筛选的单菌落进行PCR鉴定。将鉴定的阳性菌落进行测序和BLAST比对分析。

测序正确的克隆质粒和pET-30a(+)载体进行双酶切反应，将回收的β-catenin基因片段与pET-30a(+)载体以T4DNA连接酶于16℃连接过夜，构建重组质粒β-catenin-pET-30a(+)。重组质粒转化到E.coliDH5α感受态细胞中，经卡那霉素抗性筛选后，挑取单菌落再次进行PCR鉴定和质粒双酶切鉴定。

1.2.3 β-catenin原核表达 将重组质粒转化E.coliRosetta (DE3)感受态细胞中，涂布LB固体培养基，37℃培养过夜。随机挑取6个单菌落接种至5 ml LB液体培养基(含50 μg/ml卡那霉素)中，诱导β-catenin表达(1 mmol/L IPTG，37℃诱导6 h)，以8% SDS-PAGE检测。以转化pET-30a(+)质粒的E.coliRosetta (DE3)为阴性对照组。

1.2.4 β-catenin诱导温度与诱导时间优化 将工程菌接种于5 ml LB液体培养基(含50 μg/ml卡那霉素)中，设置诱导温度为30℃，以1.0 mmol/L IPTG分别诱导0、2、4、6、8、10、12 h。在各时间点等量收集菌体，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis软件进行β-catenin表达量分析。将诱导温度设置为25℃和20℃，重复上述操作。

1.2.5 β-catenin最佳表达条件确定 等量收集30℃诱导8 h、25℃诱导10 h和20℃诱导10 h的菌体，用适量TBS(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl pH8.0)重悬后以超声波法裂解菌体。离心收集裂解后的上清液和沉淀，以8% SDS-PAGE分析β-catenin的可溶表达。

1.2.6 IPTG诱导浓度优化 工程菌分别以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG，25℃诱导10 h，等量收集菌体，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis软件分析不同IPTG诱导浓度条件下β-catenin表达量。

1.2.7 β-catenin分离纯化与鉴定 以确定的最佳表达条件进行工程菌大量培养，收集裂解菌体上清液，以25%饱和硫酸铵溶液沉淀后，用适量A液(25 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、50 mmol/L 咪唑 pH7.8)稀释制备粗提液。将HisTrapTM层析柱用10倍柱床体积的A液进行清洗平衡后，以0.5 ml/min流速上样。最后以B液(25 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L 咪唑 pH7.8)进行梯度洗脱并收集目的蛋白。纯化的β-catenin蛋白以8% SDS-PAGE分析，经TBS(25 mmol/L Tris、0.15 mol/L NaCl pH8.0)透析后，以BCA法定量。

将含有纯化的β-catenin蛋白泳道的电泳胶转膜，进行Western blot检测。一抗为小鼠抗His标签单抗(1∶2 000)，二抗为HRP-羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，以MaxiLuminTM化学发光液显影成像。

1.2.8 荧光偏振实验 参考相关文献[8,9]，将80 nmol/L FITC-Lef1(30 μl/孔)依次加入到384孔板中，同时将β-catenin蛋白以荧光偏振反应液(50 mmol/L Tris、10 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA pH8.0)稀释至1 000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、0 nmol/L。将上述蛋白稀释液以30 μl/孔依次加入到含有FITC-Lef1的384孔板中，每个浓度设置3组复孔。室温避光15 min，多功能酶标仪检测毫偏值(millipolarization unit,mP)。以GraphPad Prism软件拟合结合曲线并计算结合反应的解离常数(Dissociation constant)即Kd值。

1.2.9 抗人β-catenin多克隆抗体的制备 采用参考文献所述的方法[10]，用β-catenin蛋白作为免疫原，免疫原剂量为200 μg/(只·次)。首次免疫将抗原与等体积Freund完全佐剂充分混合乳化，大鼠皮下注射。间隔3周后进行第二次加强免疫，将抗原与等体积Freund不完全佐剂充分混合乳化，皮下注射。第二次免疫后的第7 d，大鼠尾尖采血，以ELISA法检测抗血清效价。抗血清效价设定标准：抗血清效价≥1∶70 000。如达到效价，取全血分离血清备用。

1.2.10 抗人β-catenin多克隆抗体效价检测 将β-catenin蛋白(10 μg/ml；100 μl/孔)包被96孔酶标板后，以10%牛血清白蛋白37℃封闭2 h。PBST洗板3次后，加入以2倍倍比稀释的大鼠抗血清(1∶1 000～1∶1 024 000；100 μl/孔)，每组3个复孔，室温孵育1 h，同时以动物免疫前血清作为阴性对照组。加入HRP-山羊抗大鼠IgG后，37℃孵育1 h。TMB溶液显色后，以多功能酶标仪检测OD450值。S/N=OD稀释抗血清/OD阴性对照，阳性样品判断标准为S/N≥3.0。

1.2.11 抗人β-catenin多克隆抗体抗原特异性检测 将含有β-catenin蛋白(0.5、1、2 μg)的电泳胶转膜进行Western blot检测。一抗为抗人β-catenin多克隆抗体(1∶10 000)，二抗为HRP-羊抗大鼠IgG(1∶5 000)，以MaxiLuminTM化学发光液显影成像。将HeLa、A549、HepG2、HT29、MCF-7和MRC-5细胞裂解，同法检测细胞裂解液中的内源β-catenin。

2 结果

2.1 β-catenin原核表达质粒构建 以GST-β-catenin-pGEX-4T-1重组质粒为模板，利用PCR反应扩增出约1 932 bp的特异片段，其与β-catenin基因片段理论大小一致(图1A)。将β-catenin基因片段与pET-30a(+)载体连接构建重组质粒β-catenin-pET-30a(+)，随机挑取经蓝白斑筛选的单菌落进行PCR鉴定。电泳结果表明，所有菌落均可扩增出约1 932 bp的特异片段(图1B)。重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，再次得到了约1 932 bp的特异片段(图1C)。上述结果表明，成功构建了β-catenin原核表达质粒。

2.2 β-catenin原核表达 6株工程菌以1 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h后，等量收集的菌体进行8% SDS-PAGE分析β-catenin原核表达。实验结果显示，与阴性对照组相比，工程菌经IPTG诱导后，在分子量77 kD处有明显的蛋白表达条带，其与β-catenin理论分子量基本一致(图2)。这表明成功进行了β-catenin原核表达。

图1 β-catenin原核表达质粒的构建Fig.1 Construction of bacterial expression plasmid of human β-catenin proteinNote: A.PCR product of β-catenin gene；M.DNA marker；1.β-catenin gene product；B.PCR products of six random positive clones；M.DNA marker；1-6.β-catenin gene product from β-catenin-pET-30a(+)/E.coli DH5α；C.Dual-restriction enzyme digestion map for β-catenin-pET-30a(+) plasmid；M.DNA marker；1.β-catenin gene product digested with BamHⅠ/XhoⅠ.

图2 β-catenin原核表达Fig.2 Bacterial expression of human β-catenin proteinNote: 1.Negative control；M.Protein marker；2-7.Positive clones.

2.3 β-catenin诱导温度与诱导时间优化 工程菌经不同诱导温度和诱导时间培养后，离心收集等量菌体，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis软件分析β-catenin表达量。实验结果表明，诱导温度为30℃时，最佳诱导时间为8 h，此时β-catenin表达量约为12.96%并趋于稳定(图3A)；诱导温度为25℃时，最佳诱导时间为10 h，此时β-catenin表达量约为12.83%并趋于稳定(图3B)；诱导温度为20℃时，最佳诱导时间为12 h，此时β-catenin表达量约为12.23%并趋于稳定(图3C)。

图3 β-catenin诱导温度与诱导时间优化Fig.3 Determination of an optimal temperature and dur-ation of induction for human β-catenin protein expressionNote: A,B,C.SDS-PAGE analysis of human β-catenin protein bacterial expression at 30℃ (A),25℃ (B) and 20℃ (C) for 0-12 h；1.Negative control；M.Protein marker；2-8.Total cell proteins (TCP),0 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h.

图4 β-catenin最佳表达条件确定Fig.4 Determination of an optimal culture condition for human β-catenin protein expression Note: M.Protein marker；1.TCP (30℃)；2.Supernatant (30℃)；3.Pellet (30℃)；4.TCP (25℃)；5.Supernatant (25℃)；6.Pellet (25℃)；7.TCP (20℃)；8.Supernatant (20℃)；9.Pellet (20℃).

2.4 β-catenin最佳表达条件确定 等量收集30℃诱导8 h、25℃诱导10 h和20℃诱导12 h的菌体，将菌体以超声波法裂解后，上清液和沉淀以8% SDS-PAGE分析。实验结果表明，30℃诱导8 h时，β-catenin大部分以包涵体形式表达，上清液中的目的蛋白含量较少；25℃诱导10 h和20℃诱导12 h时，上清液中β-catenin表达量明显增多，沉淀中目的蛋白含量减少，β-catenin基本以可溶形式表达(图4)。

2.5 最佳IPTG诱导浓度确定 工程菌以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG于25℃诱导10 h，等量收集菌体以8% SDS-PAGE分析。实验结果表明，随着IPTG诱导浓度的逐渐增加，β-catenin表达量基本维持在12%左右并趋于稳定，IPTG诱导浓度对β-catenin表达量影响较小(图5)。

综上所述，确定β-catenin最佳表达条件为0.2 mmol/L IPTG诱导浓度，25℃诱导10 h。

2.6 β-catenin分离纯化与鉴定 工程菌以确定的最佳表达条件进行大量培养，菌体裂解上清液以25%饱和硫酸铵溶液沉淀后制备粗提液，经HisTrapTM层析柱分离纯化后，收集的样品以8% SDS-PAGE进行分析。实验结果显示，在分子量77 kD处获得了纯度较高的β-catenin蛋白(图6A)。用抗His标签抗体进行Western blot分析，结果表明可在相同分子量位置显现特异条带，证实了β-catenin的正确表达(图6B)。纯化的β-catenin蛋白经TBS透析和BCA法定量后，其浓度为1.2 mg/ml。

2.7 β-catenin生物学活性鉴定 细胞核内β-catenin/Lef1相互作用是Wnt/β-catenin信号通路中最重要的转录调控方式[1,5]。根据参考文献[11]，将FITC-Lef1探针作为转录因子Lef1的模拟物，以荧光偏振实验检测β-catenin与探针的相互作用。实验结果表明，随着β-catenin蛋白浓度的不断升高，mP值也逐渐升高并趋于稳定，结合反应具有明显的量效关系，Kd值约为66.5 nmol/L(图7)，这表明β-catenin蛋白具有良好的生物学活性。

图5 β-catenin最佳IPTG诱导浓度确定Fig.5 Determination of an optimal IPTG concentration for human β-catenin protein expressionNote: M.Protein marker；1.0 mmol/L IPTG；2.0.2 mmol/L IPTG；3.0.4 mmol/L IPTG；4.0.6 mmol/L IPTG；5.0.8 mmol/L IPTG；6.1.0 mmol/L IPTG.

2.8 抗人β-catenin多克隆抗体效价测定 用β-catenin蛋白包被酶标板，ELISA方法检测抗人β-catenin多克隆抗体效价，以大于阴性血清OD450值3倍的最小稀释倍数值作为多克隆抗体的效价。检测结果表明，纯化的β-catenin蛋白具有良好的免疫原性，制备的抗人β-catenin多克隆抗体效价为 1∶128 000(图8)。

图6 β-catenin分离纯化与鉴定Fig.6 Purification and identification of human β-cate-nin proteinNote: A.Purification of human β-catenin protein；M.Protein marker；1.Precipitated human β-catenin protein by 25% saturated ammonium sulfate solution；2-5.Purified human β-catenin protein；B.Identification of human β-catenin protein by Western blot assay；1.Protein marker；2.Human β-catenin protein band (77 kD).

图7 β-catenin生物学活性鉴定Fig.7 Biological activity analysis of purified β-cateninprotein

2.9 抗人β-catenin多克隆抗体抗原特异性测定 将抗人β-catenin多克隆抗体(1∶10 000)作为一抗，分别与β-catenin蛋白和细胞内源β-catenin反应，以Western blot实验检测其抗原特异性。实验结果表明，不同剂量的β-catenin蛋白与多抗孵育后，在分子量77 kD左右均显现特异条带，随着β-catenin剂量的增多，特异条带逐渐增粗(图9A)；6株细胞裂解液在分子量86 kD位置也呈现出特异条带(图9B)。上述结果说明，抗人β-catenin多克隆抗体具有良好的抗原特异性，均能与β-catenin蛋白和细胞内源β-catenin特异结合。

图8 ELISA检测抗人β-catenin多克隆抗体效价Fig.8 Analysis of anti-β-catenin polyclonal antibody titer using ELISA

图9 Western blot实验鉴定抗人β-catenin多克隆抗体抗原特异性Fig.9 Analysis of immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody by Western blot assayNote: A.The immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody against recombinant β-catenin protein by Western blot assay；1.0.5 μg β-catenin protein；2.1 μg β-catenin protein；3.2 μg β-catenin protein；B.The immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody against endogenous β-catenin protein in cancer and normal cells by Western blot assay；1.HeLa cell；2.A549 cell；3.HepG2 cell；4.HT29 cell；5.MCF-7 cell；6.MRC-5 cell.GAPDH was used as the loading control.

3 讨论

β-catenin介导的转录调控(β-catenin responsive transcription,CRT)作为Wnt/β-catenin信号通路的核心调控方式，广泛参与肿瘤细胞的生长、分化、浸润、转移与肿瘤干细胞休眠体形成，促进肿瘤耐药与复发，已成为新型高选择性抗肿瘤药物开发的理想靶标之一[1,2,4,5]。深入研究β-catenin在Wnt信号通路中的调控功能，尤其是调控肿瘤免疫耐受的分子机制研究，对未来肿瘤免疫治疗具有重要意义[7]。抗体是蛋白功能研究的重要工具，但目前针对抗人β-catenin多克隆抗体制备国内还未有相关报道。特异性抗人β-catenin多克隆抗体制备对深入研究β-catenin在肿瘤免疫耐受中的生物学功能具有重要意义。

多克隆抗体制备具有操作简单、制备周期短和特异性高等诸多优点，已成为抗体制备的重要方法。很多研究者采用大肠杆菌原核表达重组蛋白，将其作为抗原免疫大鼠、小鼠或新西兰白兔后成功制备了多种高特异性多克隆抗体用于蛋白功能研究[10,12-15]。由于His标签分子量较小，几乎不影响目的蛋白的理化性质，且方便重组蛋白的纯化和检测[16,17]，故此本研究采用pET-30a(+)载体的His标签融合表达策略进行了人β-catenin核心功能结构域(138-781 aa)的原核表达。与已报道的GST-β-catenin-His双标签融合表达策略相比[18,19]，本研究建立的人β-catenin原核表达策略具有更好的简便性、实用性和经济性。

鉴于诱导温度和诱导时间是影响外源基因在大肠杆菌系统表达的重要因素[20]，我们通过原核表达优化以提高目的蛋白表达量和促进可溶表达。β-catenin原核表达优化实验结果表明，诱导温度和时间对β-catenin的表达量有重要影响。30℃诱导8 h时，β-catenin易于形成包涵体；25℃和20℃低温诱导过夜则使β-catenin包涵体量减少，促进了其可溶表达，这可能与低温可减慢蛋白的表达速率并有利于蛋白质正确折叠有关[20]。另外，我们发现IPTG诱导浓度对β-catenin表达量影响不大，低浓度的IPTG即可诱导β-catenin大量表达。

荧光偏振技术(Fluorescence polarization,FP)主要基于偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关的检测原理，被广泛应用于药物筛选、疾病诊断及大分子活性鉴定[8,9,21,22]。我们以FITC-Lef1探针作为转录因子Lef1的模拟物，应用FP实验证实了β-catenin蛋白能与FITC-Lef1特异结合，Kd值约为66.5 nmol/L。这表明制备的β-catenin蛋白具有良好的生物学活性。

利用纯化的β-catenin蛋白作为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体，以ELISA实验和Western blot实验进行了抗体效价和抗原特异性检测。ELISA实验表明，制备的抗人β-catenin多克隆抗体效价可达1∶128 000。Western blot实验显示多抗不仅能特异识别β-catenin重组蛋白，还能与细胞内源β-catenin特异结合，这表明制备的抗人β-catenin多克隆抗体具有良好的抗原特异性。另外，我们发现β-catenin蛋白在大部分肿瘤细胞中呈高水平表达，在正常细胞中则呈低水平表达。

综上所述，本实验成功进行了人β-catenin蛋白原核表达优化、特异性多克隆抗体的制备与鉴定，为深入研究β-catenin在肿瘤免疫耐受中的生物学功能奠定了实验基础。

致谢：衷心感谢中国科学院大学存济医学院袁莉教授和中国医学科学院-北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室李霓副研究员在β-catenin原核表达方面给予的悉心指导和无私帮助！