lncRNA MAGI2-AS3调控Fas/FasL通路抑制神经母细胞瘤的生长

黄垂名 张小波 彭小旅

(海南省人民医院小儿外科，海口570100)

神经母细胞瘤是较为常见的神经系统恶性肿瘤，据统计我国每年发病儿童达上千例，且患病儿童常在晚期发现，患儿治疗困难，预后差，严重影响患者的身心健康[1]。神经母细胞瘤中细胞的异常增殖与细胞侵袭是导致神经母细胞瘤患者死亡的主要原因，Fas/FasL通路在细胞的增殖、凋亡中发挥重要作用[2]。近年来随着对肿瘤研究的深入，已经从编码蛋白RNA层面逐渐延伸到非编码RNA(lncRNA)。LNCRNs是一类长度超过200个核苷酸的内源性非编码蛋白质RNA，其在胚胎发育、细胞增殖、细胞分化中发挥重要作用[3]。多项研究表明lncRNA的调控机制与肿瘤的发生、发展相关。lncRNA HOTAIR 在肿瘤的进展中发挥重要作用，其通过重组染色质促进癌转移[4]；lncRNA TUG1过表达促进宫颈癌细胞增殖和迁移[5]。MAGI2-AS3是近年来新发现的lncRNA，其在乳腺癌中发挥重要作用[6]。但其在神经母细胞瘤中的研究鲜有报道，故本研究通过组织学和分子学机制探究lncRNA MAGI2-AS3在Fas/FasL通路中对神经母细胞瘤的调控作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 材料与仪器 人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y、SK-N-SH均购自中国科学院。MAGI2-AS3慢病毒颗粒(LV-MAGI2-AS3)和对照慢病毒颗粒(LV-NC)购自上海GenePharma Bio。DMEM培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)，胎牛血清(FBS，美国Gibco-BR)，胰蛋白酶(美国Difo公司)，DMSO(美国Amresco公司)，Trizol试剂盒、RNA反转录试剂盒(中国大连TaKaRa公司)，SYBR Prime Script RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，BCA蛋白试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，PVDF微孔滤膜(美国Bio-Rad 公司)，β-肌动蛋白抗体(美国ABcam公司)，Fas抗体、FasL抗体(美国Proteintech公司)，二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(美国Pierce公司)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，上海生物技术研究所)，多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，FACS流式细胞仪(美国BD公司)，CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)，凝胶成像系统(美国UVP公司)，离心机、荧光定量仪(德国Eppendorf公司)。

1.1.2 临床资料 本研究选用2016年1月至2018年6月在本院接受治疗的23例神经母细胞瘤患者为研究对象，其中男11例，女12例，年龄5个月～14岁，平均(4.15±3.06)岁；按照国际神经母细胞瘤分期系统进行临床分期：Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期15例。手术采集患者癌组织和癌旁正常组织，采集后比标号所有组织样本保存于液氮中。经医院伦理委员会批准同意，所有患者及监护人均知情同意且签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与慢病毒处理 人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y、SK-N-SH培养在含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，当细胞融合度达到80%左右时，弃掉培养基，适量PBS清洗，使用0.25% 的胰蛋白酶进行消化，消化完成后用含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，1 000 r/min离心收集细胞，接种到25 cm2细胞培养瓶中继续培养，每2 d换液，3～4 d传代，稳定传代2～3代，收集对数期细胞进行实验。

收集对数期的SH-SY5Y、SK-N-SH细胞，每种细胞分为3组，每组做3个重复，control组(control)未转染慢病毒颗粒，LV-NC组为转染空载，LV-MAGI2-AS3组为转染MAGI2-AS3慢病毒颗粒，转染步骤按照说明书进行。在病毒转染前用5 μg/ml聚丁烯(GenePharma Bio)处理80%融合细胞，1 d后转入新鲜培养基。转染后细胞于37℃、5%CO2培养箱继续培养，收集转染后0、24、48、72 h的细胞荧光显微镜检测转染效率。

1.2.2 qRT-PCR检测组织(细胞)中mRNA的表达 收集转染后各细胞系对数期细胞，用Trizol法抽提组织(细胞)总RNA，反转录试剂盒反转录为cDNA，荧光定量PCR仪进行qRT-PCR检测各细胞系MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA相对表达量。SYBR Green法qRT-PCR反应体系为25 μl：SYBR GreenⅡMaster Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O补足25 μl；参数设置为95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40个循环。以β-actin为管家基因。采用Primer Premier5.0 设计引物，由上海生工合成，引物序列见表1。

1.2.3 细胞增殖情况的检测 采用CCK-8方法检测细胞增殖情况。收集各组细胞悬液于96孔板中(100 μl/孔)，每组设置3个平行对照，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光值，分析细胞增殖情况。

1.2.4 细胞凋亡的检测 采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。胰蛋白酶进行消化，室温2 000 r/min离心5 min收集各组细胞；PBS洗涤细胞2次，调整细胞为1×106ml-1；吸取1 ml细胞悬浮液，加入 500 μl 的结合缓冲液混合，上机前加入5 μl碘化丙啶(PI)和 5 μl 膜联蛋白-V(Annexin-V)，室温避光反应10 min，1 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在神经母细胞瘤组织中的表达 对23例神经母细胞瘤患者进行qRT-PCR检测癌组织和正常组织的MAGI2-AS3表达水平。结果显示，MAGI2-AS3 mRNA在神经母细胞瘤组织中的表达显著低于相对应的正常组织(图1A)。对Fas、FasL mRNA表达水平进行检测，结果发现神经母细胞瘤组织Fas、FasL mRNA表达较正常组织均显著降低(图1B、C)，见表2。

2.2 lncRNA MAGI2-AS3的表达与神经母细胞瘤患者临床病理参数的关系 根据lncRNA MAGI2-AS3表达水平的中位值分为高表达组共16例，低表达组共7例，观察lncRNA MAGI2-AS3表达与神经母细胞瘤患者临床病理参数的关系，结果显示lncRNA MAGI2-AS3与临床分期、组织分化程度有关，差异均具有统计学意义(P<0.05)，与年龄、肿瘤大小、浸润深度无显著相关。详见表3。

2.3 转染效率的检测 采用转染慢病毒上调SK-N-SH、SH-SY5Y 两个神经母细胞瘤细胞系中MAGI2-AS3表达水平，用荧光显微镜法测定感染效率，结果表明转染MAGI2-AS3慢病毒(LV-MAGI2-AS3)可显著提高MAGI2-AS3在神经母细胞中的表达(图2A、B)。qRT-PCR检测结果显示转染LV-MAGI2-AS3的MAGI2-AS3表达水平显著高于转染LV-NC和control组。

表1 引物信息

Tab.1 Primer information

GeneForward primer(5'-3')Reverse primer(5'-3')β-actinGGTCTCAAACATGATCTGGGGGGTCAGAAGGACTCCTATGMAGI2-AS3CACCTTGCTTGACAACTTGACATTACAGCTCGGCTACTGCFasCTGGATTTAGGAATTGCTCTTGTCAGGTGGTTCCAGGTATCTGCTTCAFasLTGCACACAGCATCATCTTTGGAAGGCATGGACCTTGAGTTGGAC

图1 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在组织中的表达水平Fig.1 Expression of lncRNA MAGI2-AS3,Fas and FasL mRNA in tissuesNote: ***.P<0.001.

表2 lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL mRNA在组织中的表达水平

Tab.2 Expression of lncRNA MAGI2-AS3,Fas and FasL mRNA in tissues

GroupsnMAGI2-AS3FasFasL Normal group231.02±0.291.01±0.310.91±0.28Colon cancer group23 0.48±0.211)0.52±0.201)0.50±0.181)

Note：Compared with the normal group,1)P<0.001.

表3 lncRNA MAGI2-AS3的表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

Tab.3 Relationship between expression of lncRNA MAG-I2-AS3 and clinicopathological features of patients[n(%)]

图2 lncRNA MAGI2-AS3的过表达情况和lncRNA MAGI2-AS3 mRNA的表达水平(×400)

Fig.2 Overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 and express-ion level of lncRNA MAGI2-AS3(×400)

Note: ***.P<0.001.

图3 过表达lncRNA MAGI2-AS3对Fas、FasL mRNA表达水平的影响Fig.3 Effects of overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 on Fas and FasL mRNA expression levelsNote: ***.P<0.001.

2.4 过表达LncRNA MAGI2-AS3对神经母细胞瘤细胞Fas、FasL mRNA的影响 qRT-PCR检测过表达LncRNA MAGI2-AS3对SK-N-SH、SH-SY5Y细胞系中Fas、FasL mRNA表达的影响，结果显示，过表达 LncRNA MAGI2-AS3后Fas、FasL mRNA表达水平显著高于LV-NC组和control组(图3A、B)，Fas/FasL是肿瘤发生过程中的关键调控因子，由结果表明MAGI2-AS3可能通过抑制Fas/FasL信号转导抑制神经母细胞瘤细胞增殖。

2.5 过表达LncRNA MAGI2-AS3对神经母细胞瘤细胞增殖的影响 CCK-8检测过表达LncRNA MAGI2-AS3后，SK-N-SH、SH-SY5Y细胞系的增殖情况，结果显示，感染LV-MAGI2-AS3的两个细胞系增殖率均显著降低，显著低于LV-NC组和control组，LV-NC组和control组无显著变化(图4A、B)。

图4 过表达lncRNA MAGI2-AS3对神经母细胞瘤增殖的影响Fig.4 Effect of overexpression of lncRNA MAGI2-AS3 on proliferation of neuroblastomaNote: **.P<0.05,***.P<0.001.

表4 各组细胞凋亡率比较

Tab.4 Comparison of apoptotic rate in each group

GroupsSK-N-SHSH-SY5YControl6.38±1.106.65±1.22LV-NC7.16±1.217.32±1.26LV-MAGI2-AS312.68±2.431)2)13.16±2.441)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with LV-NC group,2)P<0.05.

2.6 过表达LncRNA MAGI2-AS3对神经母细胞瘤细胞凋亡的影响 三组细胞凋亡率组进行比较，结果显示LV-MAGI2-AS3z组细胞凋亡率显著高于LV-NC组和control组，LV-NC组和control组凋亡率比较无显著差异。详见表4。

3 讨论

神经母细胞瘤是儿童较为常见的交感神经系统的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内正在增加。目前对肿瘤的治疗主要是外科手术和化疗，来延长患儿的生存时间，但治疗方式具有严重的副作用。研究发现，多种基因与神经母细胞瘤的发生发展相关，且肿瘤细胞的生长不仅与细胞增殖相关，还与细胞异常凋亡密切相关[7]。近年来发现，LncRNA的失调可能影响表观遗传信息，促进细胞的无限增长，进而导致肿瘤的生成[8]。但是LncRNA影响肿瘤的分子机制尚不清楚，因此LncRNA在肿瘤发生发展中的作用备受关注。

基因调控对癌细胞活性具有重要作用，LncRNA可以调节肿瘤细胞的生物活性。特别是癌症的转录和转录后水平[9,10]。Liu 等[11]研究发现lncRNA GHET1通过上皮间质转变(Epithelial mesenchymal transition)促进食管鳞癌细胞的增殖。Yu 等[12]报道，HOXA11-AS通过调节LATS1的表达促进肝细胞癌增殖。MAGI2是一种具有募集和锚定作用的支架蛋白，研究发现，MAGI2在脑组织中高表达，且是一种潜在的肿瘤抑制因子。研究报道，MAGI2抑制肝癌细胞的增殖、迁移及促进其凋亡[13]。Yang等[14]报道，lncRNA MAGI2-AS3 通过抑制乳腺癌细胞的增殖。本研究通过对神经母细胞瘤患者的肿瘤组织和正常组织的检测发现，lncRNA MAGI2-AS3在肿瘤组织中的表达显著低于正常组织，且Fas、FasL的表达也处于低水平，这表明神经母细胞瘤患者的肿瘤组织中lncRNA MAGI2-AS3处于低表达水平。还研究了MAGI2-AS3表达与神经母细胞瘤患者临床病理参数之间的关系，结果表明lncRNA MAGI2-AS3与临床分期、组织分化程度有关，且呈负相关。通过临床参数和组织检测发现lncRNA MAGI2-AS3在神经母细胞瘤中具有重要作用。

为了进一步研究MAGI2-AS3在神经母细胞瘤中的作用，我们用LV-MAGI2-AS3转染神经母细胞瘤细胞，以上调MAGI2-AS3的表达，结果显示MAGI2-AS3表达上调。Fas是肿瘤坏死因子受体家族的细胞表面受体，通过与肿瘤坏死因子天然配体FasL相互作用，启动外源性凋亡途径诱导细胞凋亡，Fas/FasL途径是细胞凋亡的关键调控因子[15,16]。因此，Fas/FasL通路在肿瘤抑制中起着重要的作用[17]。Zhang等[18]研究报道，LncRNA LIcN900152通过调控Fas表达诱导细胞凋亡，降低CSC细胞的存活率。lncRNA MAGI2-AS3 通过调控Fas/FasL通路促进乳腺癌细胞的凋亡。石萌等[19]报道，miRNA 通过Fas调控胃肠道肿瘤的凋亡。赵国栋等[20]报道，Fas/FasL信号通路在PBDE-47诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中具有重要作用。为了进一步阐明MAGI2-AS3抑制神经母细胞瘤细胞生长的机制，我们对Fas、FasL mRNA的表达进行检测，发现过表达MAGI2-AS3后Fas、FasL mRNA表达水平也显著升高，表明MAGI2-AS3调节Fas和FasL的表达，激活MAGI2-AS3可以导致Fas/FasL通路的激活。且过表达后MAGI2-AS3后，CCK-8检测发现细胞增殖率显著低于LV-NC和control组，通过流式细胞仪检测发现细胞凋亡率显著高于LV-NC和control组。根据这些结果表明，MAGI2-AS3在肿瘤组织中低表达，且其抑制Fas、FasL mRNA的表达，其可能是通过Fas/FasL信号通路而潜在地抑制神经母细胞瘤的生长。

综上所述，lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL在神经母细胞瘤组织和细胞系中均低表达，过表达lncRNA MAGI2-AS3引起Fas、FasL的表达上调，表明MAGI2-AS3可能通过抑制Fas/FasL信号通路而潜在地抑制神经母细胞瘤的生长，但是其具体的作用机制有待进一步研究。