藏红花素通过HIF-1α/VEGF通路对缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞血管新生的抑制作用

闫义涛 王晓丽 谷圆圆 任艳凡 胡俊喜

(新乡医学院第一附属医院眼科，新乡453003)

失明或视力障碍严重影响人类生活质量。视网膜血管新生是造成早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性等各个年龄阶段眼病致盲及视力障碍的主要原因[1,2]。大量研究揭示了抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)疗法对视网膜疾病的疗效[3]。但目前的抗VEGF药物成本效益并不理想，且会产生眼部或全身性的副作用，如眼内炎、眼内出血和视网膜脱离、心肌梗死、中风等[4-6]。开发安全有效的眼病治疗方法迫在眉睫。长期以来藏红花因具有抗氧化，抗炎及免疫调节等生物活性而被作为多种疾病的治疗药物[7,8]。藏红花素(化学结构式见图1)是藏红花的主要成分，是一种类胡萝卜素衍生物，有利于神经系统疾病、心血管疾病及癌症的治疗[9-12]。据报道藏红花素还具有保护缺血再灌注诱导的视网膜损伤功能[13]。但藏红花素对视网膜细胞血管新生的作用还有待进一步研究。本文的主要目的是通过氯化钴处理视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelial,RPE)细胞建立缺氧模型，探索藏红花素对缺氧诱导的RPE细胞血管新生的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 RPE细胞来源于美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。培养基 DMEM及胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司。藏红花素和氯化钴购自Sigma公司。MTT购自上海生工。血管生成载玻片购自德国Ibidi公司。Matrigel胶购自BD公司。抗HIF-1α抗体、鼠抗VEGF抗体、鼠抗鼠VEGR2抗体和兔抗P-P38抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与药物处理 RPE细胞在添加了10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基中于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。当细胞增殖到约80%时进行传代。RPE细胞分为5组：对照组(RPE)、缺氧组(CoCl2)、藏红花素组(CoCl2+5、10、25 μmol/L藏红花素)。缺氧组用200 mmol/L的CoCl2处理。藏红花素组用200 mmol/L的CoCl2联合5、10、25 μmol/L藏红花素进行处理。对照组用DMSO处理。

1.2.2 MTT检测细胞增殖 按照上述分组对RPE细胞进行处理后置于培养箱中培养，在各个检测时间点加入MTT溶液孵育4 h，弃上清后加入DMSO振荡10 min溶解结晶物。最后570 nm处检测吸光值。

1.2.3 流式分选检测血管内皮细胞标记物CD31和CD34水平 首先收集各组细胞并制成1×106个/ml的细胞悬液，然后分别加入鼠抗CD31或鼠抗CD34抗体孵育30 min，漂洗后加入异硫氰酸(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的鼠二抗孵育30 min。最后将经过染色标记的上述细胞放入流式细胞仪进行分析。

1.2.4 血管生成实验 首先将Matrigel胶放入4℃冰箱过夜以便将其缓慢融化。第2天将融化的Matrigel胶加入血管生成载玻片中，放入培养箱中包被30 min。然后将各组细胞制成6×104个/ml的细胞悬液加入到血管生成载玻片中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养18 h。最后取出显微镜下拍照并统计微管长度和分支数。

图1 藏红花素化学结构式Fig.1 Chemical structure of crocin

1.2.5 蛋白印迹 首先用PBS将细胞清洗3次后，加入添加了蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白，100℃变性5 min。然后等量的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，接着5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。接着加入发光液置于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.3 统计学方法 用SPSS16.0软件进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05表示存在统计学意义。

2 结果

2.1 藏红花素对RPE细胞活力的影响 不同浓度(0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)的藏红花素处理RPE细胞后，利用MTT检测细胞毒性。图2 显示，藏红花素小于25 μmol/L时对RPE细胞无明显毒性，细胞存活率大于80%。藏红花素大于25 μmol/L后，细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞存活率低于80%。选择无毒性的3个浓度(5、10、25 μmol/L)的藏红花素进行后续实验。

2.2 藏红花素可抑制缺氧诱导的RPE细胞增殖 通过MTT检测藏红花素对缺氧诱导的RPE细胞增殖能力的影响。如图3所示，缺氧组RPE细胞增殖明显高于对照组(P<0.05)。藏红花素(10、25 μmol/L) 处理可明显降低缺氧诱导的RPE细胞增殖的升高(P<0.05)。结果表明，藏红花素(10、25 μmol/L)处理会抑制缺氧诱导的RPE细胞增殖。

图2 藏红花素对RPE细胞活力的影响Fig.2 Effect of crocin on cell viability of RPENote: *.P<0.05 vs 1 μmol/L.

2.3 藏红花素会降低缺氧诱导的RPE细胞中血管内皮细胞标记物表达 为分析藏红花素对缺氧诱导的RPE细胞中血管内皮细胞标记物的影响，利用流式分选技术检测RPE细胞中CD31和CD34水平。由图4可知，缺氧组CD31和CD34阳性细胞数目明显多于对照组(P<0.05)。5 μmol/L的藏红花素处理可降低缺氧诱导的RPE细胞中CD31阳性细胞数目的增多(P<0.05)。10、25 μmol/L藏红花素会减少缺氧诱导的RPE细胞中CD31和CD34阳性细胞数目(P<0.05)。由此可见，藏红花素可降低缺氧诱导的RPE细胞中CD31和CD34分泌。

图3 MTT检测细胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by MTTNote: *.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs hypoxia group.

2.4 藏红花素可减弱缺氧诱导的RPE细胞血管新生 采用血管生成实验检测微管长度和分支数，探究藏红花素对缺氧诱导的RPE细胞血管新生能力的影响。图5显示，缺氧会造成RPE细胞血管新生过程中微管长度变长和分支数变多(P<0.05)。10、25 μmol/L藏红花素处理会抑制缺氧诱导的RPE细胞血管新生过程中微管长度和分支数(P<0.05)。以上结果说明，10、25 μmol/L藏红花素可减弱缺氧诱导的RPE细胞血管新生能力。

2.5 藏红花素对血管新生相关蛋白表达的影响 为分析藏红花素影响缺氧诱导的RPE细胞血管新生的分子机制，蛋白印迹检测血管新生相关蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38表达。由图6可知，缺氧组HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平明显高于对照组(P<0.05)。与缺氧组相比，5 μmol/L的藏红花素组VEGR2蛋白水平明显降低；10、25 μmol/L藏红花素组HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平则明显下降(P<0.05)。由此可见，藏红花素处理会抑制缺氧诱导的RPE细胞血管新生相关蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白表达水平。

图4 流式分选检测CD31和CD34水平Fig.4 Levels of CD31 and CD34 were tested by flow cytometerNote: *.P<0.01vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

图5 Matrigel实验检测血管生成Fig.5 Angiogenesis was measured by Matrigel assayNote: *.P<0.01 vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

图6 蛋白印迹检测血管新生相关蛋白表达Fig.6 Expression of angiogenesis related proteins was tested by Western blotNote: *.P<0.01 vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

3 讨论

据调查，2010年全世界有3 240万人失明，19 100万人患有中度或重度视力障碍[14]。由于人口老龄化的加剧，预计未来全球各种眼病负担会不断加大，且治疗费用也将上升[15-17]。眼病治疗是公共卫生健康系统的重大课题。研究表明许多植物提取物在各种疾病方面发挥着重要作用[18,19]。

研究表明RPE细胞不受控的增殖会激发视网膜血管新生[20]。大量文献报道多种植物提取物具有抑制细胞异常增殖的功能。有数据显示草药三果宝的主要活性物质诃子鞣质和柯黎勒酸可抑制TGFβ1诱导的视网膜色素上皮细胞ARPE-19增殖[21]。据报道白藜芦醇可抑制缺氧诱导的视网膜血管内皮细胞RF/6A增殖的升高[22]。有研究发现藏红花素具有降低肺癌细胞A549 和SPC-A1增殖的功效[23]。有数据显示藏红花素可抑制白血病Jurkat细胞增殖[24]。Lu等[25]发现藏红花素会减弱乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力。本文结果表明，藏红花素处理可降低缺氧诱导的RPE细胞增殖。

据报道内皮组细胞向血管内皮细胞分化的过程中CD31和CD34阳性细胞数目会增加，CD31和CD34常被用作血管内皮细胞标记物，衡量血管新生[26]。许多植物提取物在抑制各类疾病的血管内皮细胞标记物分泌方面发挥着积极作用。Zhou等[27]研究显示金银花提取物可降低糖尿病视网膜病变小鼠视网膜CD31的分泌。据报道富含番茄红素的番茄提取物可抑制亚硝基二乙基胺诱导的肝癌小鼠CD31释放[28]。有数据显示圆柏提取物可降低肝癌肿瘤组织中CD31的水平[29]。有研究表明鼓槌石斛的乙醇提取物可减弱糖尿病大鼠视网膜CD31的分泌[30]。本文结果显示，藏红花素会抑制缺氧诱导的RPE细胞中CD31和CD34的分泌。

血管新生在各类疾病的进程中起着重要作用。大量研究表明多种植物提取物可抑制血管新生。Vavilala等[31]发现木兰属植物提取物秦皮乙素氧可降低缺氧诱导视网膜病变小鼠视网膜血管新生。有数据显示野艾蒿提取物可减弱人脐静脉内皮细胞管腔形成[32]。据报道川芎提取物的主要活性物质丁烯基酞内酯可抑制人脐静脉内皮细胞的血管新生[33]。有研究表明莲花叶提取物可降低乳腺癌细胞的血管新生能力[34]。Umigai等[35]发现藏红花素可抑制VEGF诱导的视网膜内皮细胞血管新生。本研究结果显示，藏红花素具有减少缺氧诱导的RPE细胞血管新生过程中微管长度和分支数量的作用，可降低缺氧诱导的RPE细胞血管新生能力。

HIF-1α/VEGF通路的异常活化是视网膜新血管化的根本原因[31]。许多植物提取物可抑制HIF-1α/VEGF通路的激活。有研究发现红球姜根茎提取物可降低糖尿病大鼠视网膜VEGF表达，抑制视网膜血管新生[36]。据报道和厚朴酚可降低缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞HIF-1α和VEGF表达[37]。有数据显示桑叶提取物可抑制糖尿病大鼠视网膜VEGF表达[38]。据报道藏红花素可抑制致癌物二乙基亚硝胺诱导的肝组织VEGF表达[39]。有研究显示藏红花素会降低二嗪农诱导的大鼠心脏组织HIF-1α蛋白表达水平[40]。另外用藏红花素预处理缺血再灌注大鼠可抑制HIF-1α表达的上升[41]。本文结果显示，藏红花素处理可抑制缺氧诱导的RPE细胞血管新生相关蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白表达水平。

简而言之，在缺氧诱导的RPE细胞中，藏红花素处理可降低细胞增殖，减少CD31和CD34分泌，减弱血管新生能力，降低HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平。综上所述，藏红花素可通过HIF-1α/VEGF通路抑制缺氧诱导的视网膜细胞血管新生。后续计划将在体内探究藏红花素对视网膜血管新生的影响，为挖掘新的眼病治疗方法奠定基础。