中草药水提液抗肠道病毒71型的活性评估①

王春阳 谢广成 严琴琴 陈 敏 贺茂芳 杜向阳

(西安医学院，西安270021)

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)属于小RNA病毒科，肠道病毒属，单股正链RNA病毒，是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一，大部分重症手足口病例是由EV71感染所致[1]。EV71主要感染5岁以下婴幼儿，临床上多为自限性疾病，少数重症病例可进一步引发心肌炎、肺水肿、脑干脑炎等并发症，严重危及患儿的生命，给社会和家庭带来巨大的损失和影响。目前临床上针对EV71感染的治疗主要为对症治疗和支持治疗[2]。临床上尚没有有效的抗病毒药物。常用的西药病毒唑有一定疗效，但不良反应严重，长期应用对患儿的身体不利，而且存在耐药性[3]。中草药具有安全、毒副作用小的特点。然而关于天然中草药抗病毒活性的研究尚少，因此本研对鱼腥草、薄荷、甘草、栀子、知母、牛蒡、黄芩、连翘、防风、柴胡、川贝母以及海金沙12种中草药抗EV71活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 鱼腥草、薄荷、甘草、栀子、知母、牛蒡、黄芩、连翘、防风、柴胡、川贝母以及海金沙12种药材购于陕西省西安市医府大药房，经西安医学院药学院贺茂芳教师鉴定。水提物的制备：将烘干的药材粉碎后，称取10.0 g，加入100 ml蒸馏水，于60℃水浴锅中孵育24 h。弃去药渣，5 000 r/min离心10 min。取上清液，浓缩至20 ml，转至减压干燥机完全干燥，用含5% DMSO的细胞维持液配成10 mg/ml 母液，存于EP管中，放于-20℃冰箱备用。利巴韦林注射液(广州白云山天心制药股份有限公司，批号：120201)。

1.1.2 细胞和病毒 非洲绿猴肾上皮Vero细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。细胞培养于包含高糖的热灭活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺以及非必需氨基酸的完全DMEM中。 细胞于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。EV71病毒(阜阳株)由江苏省疾病预防与控制中心惠赠。EV71在RD细胞培养扩增后分装保存于-80℃冰箱。

1.1.3 试剂和仪器 反转录试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司。StepOneTMReal-Time PCR 仪器为美国ABI公司产品。NANODROP 2000核酸定量仪为美国Thermo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及干预方法 12种中草药水提物抗EV71活性检测的细胞分组：空白对照组(Control)、仅有EV71感染组(EV71)、12种中草药水提液处理组(水提液+EV71)、利巴韦林处理组(利巴韦林+EV71)。

1.2.2 实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)测定VP1的表达 根据RNA提取试剂盒(Qiagen，Germany)说明书提取感染细胞和未感染细胞的总RNA。用美国Thermo公司的Nanodrop测定RNA的浓度与纯度。按照TaKaRa公司的2 Step Real Time RT-PCR逆转录试剂盒(RRO36A)说明书，取500 ng RNA反转录成cDNA。然后用获得的cDNA作为模版按照TaKaRa的SYBR荧光定量Realtime PCR试剂盒(RR420A)的说明书配制PCR反应液，然后在Applied Biosystems StepOnePlusTM仪器上进行荧光定量反应。PCR反应条件是：95℃预变性30 s，然后95℃ 5 s，60℃ 30 s,进行40个循环。内参基因选取磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因。每个做3个孔，每次实验重复3次。基因的表达水平按照公式2ΔCt of Gene-ΔCt of GAPDH)进行计算。引物序列见表1。

1.2.3 12种中草药水提物抗EV71活性检测 EV71引起的细胞病变效应可以通过MTT的方法定量检测。将12种中草药水提液提前2 h加入生长旺盛的单层Vero细胞培养液中，然后EV71以MOI为0.1感染Vero细胞24 h。一方面用MTT测定细胞活力，读取A570值，利巴韦林为阳性对照。按公式计算细胞相对于对照的存活率；一方面收集上清液，用TCID50的方法测定病毒滴度，以确定中草药水提液对EV71子代病毒释放的影响；一方面提取细胞总RNA，应用Realtime PCR的方法检测VP1蛋白的表达情况。

1.2.4 病毒滴度的测定 将消化悬浮的Vero细胞接种于96孔细胞培养板内，培养12～16 h。取10个EP管，每管各加入90 μl的无血清DMEM。将病毒原液吹打均匀后吸取10 μl加入到第一管中，用枪头上下吹打混匀，从第一管中吸取10 μl加入第二管，上下吹打混匀，以此类推逐个稀释至10-8，每一次稀释都要更换枪头。然后将各稀释度的病毒加入到已培养好的Vero细胞中，每个稀释度接种8个孔，每个孔10 μl。观察并记录细胞病变情况。按照Reed-Muench方法[4]，计算TCID50。

1.2.5 药物抑制病毒感染的时间曲线 96孔板中培养Vero细胞，待细胞长成单层后，用鱼腥草水提液按图3所示时间加入到细胞中，即在病毒感染前2 h，与病毒同时加入，以及病毒感染后2、4、6、8、10、12、16、24 h(-2、0、2、4、6、8、10、12、16、24 h)加入到细胞中，待病毒感染72 h之后，用MTT方法检测药物抑制病毒感染的抑制率。

1.2.6 检测鱼腥草水提液是否直接灭活病毒 将终浓度为0.1 mg/ml的鱼腥草水提液与1×105TCID50的EV71于100 μl的无血清培养基中混合(Houttu-ynia cordata Thunb+EV71组)，37℃孵育60 min后，取混合液10 μl感染24孔板的Vero细胞，重复3个复孔，同时设置无处理的正常病毒组(EV71组)和去离子水处理的病毒组(ddH2O+EV71组)。待病毒吸附细胞2 h之后，将培养基去掉，用无血清DMEM洗3次，以去除未吸附的病毒和残留的药物。病毒感染48 h之后，收集感染的细胞和上清，用Reed-Muench法计算EV71病毒滴度。

1.3 统计学处理 采用SPSS统计软件进行统计学分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 12种中草药水提物的细胞毒性检测 MTT实验结果显示，12种中草药水提物在0.1 mg/ml的浓度下细胞活力与对照组相差无几(图1)，说明12种中草药水提物在此浓度以内对Vero细胞生长没有明显的毒性和抑制作用。

2.2 12种中草药水提液抗EV71作用 分别用12种中草药水提液(终浓度为0.1 mg/ml)预处理Vero细胞2 h，然后EV71以MOI为0.1感染细胞24 h，利巴韦林作为阳性对照。应用MTT实验检测细胞活力，与EV71感染组相比，鱼腥草水提液能够显著提高细胞的存活率(P值为0.002 8)，表明其能够显著抑制EV71感染诱导的细胞死亡(图2A)。阳性对照利巴韦林也能够显著抑制EV71诱导的细胞

图1 12种中草药水提物的细胞毒性检测Fig.1 Determination of cytotoxicity of water extracts of twelve Chinese herbs on Vero cellsNote: 1.Glyeyrrhiza uralensis Fisch；2.Gardeniu jasmionids Ellis；3.Anemarrhena asphodeloides Bunge；4.Arctium lappl L；5.Houttuynia cordata Thund；6.Forsythia suspens；7.Saposhnikovia divaricata(Trucz.) Schischk；8.Bupleurum chinense；9.Mentha haplocalyx.Briq；10.Lygodium japonicum(Thunb.)SW；11.Scutellaria baicalensis Georgi；12.Fritillaria cirrhosa,D.

死亡(P值为0.000 3)。由图2A结果可知，鱼腥草对细胞的保护作用明显优于阳性对照利巴韦林。与EV71感染组相比，薄荷水提液只能略微提高细胞的存活率。其他10种中草药水提液的细胞存活率与EV71感染组并无差异，说明这几种中草药对细胞均没有有效的保护作用。

收集细胞上清液，检测病毒滴度发现(图2B)，与病毒组相比，除了薄荷、鱼腥草水提液分别将病毒滴度降低了0.9 logs和4.15 logs(P值分别为0.006 1，0.014 3)，其他10种中草药水提液均对病毒滴度没有明显的影响。利巴韦林将病毒滴度降低了3.3 logs(P值为0.005 9)。以上结果说明薄荷和鱼腥草水提物能够抑制EV71子代病毒释放的影响，并且鱼腥草在0.1 mg/ml的浓度下，具有优于阳性对照利巴韦林的抗病毒作用。

提前用0.1 mg/ml的水提物处理细胞2 h，EV71感染Vero细胞24 h后提取RNA，应用Realtime PCR的方法检测VP1的mRNA的表达。结果表明，鱼腥草水提液和利巴韦林均能够明显降低EV71病毒蛋白VP1的表达(P值分别为0.000 8，0.009 1)，并且鱼腥草对VP1表达的抑制作用比利巴韦林更加明显(图2C)。

鱼腥草水提物检测药物抑制病毒感染的时间曲线结果显示，鱼腥草水提液预处理细胞2 h对EV71感染的抑制率为99.88%(图3A)。但是，EV71感染Vero细胞2 h后加入的鱼腥草水提液对病毒的抑制效果越来越差，说明鱼腥草在EV71进入宿主细胞之前就能抑制EV71的感染。将终浓度为0.1 mg/ml 的鱼腥草水提液与1×104TCID50的EV71预先共同孵育30 min后，再加入细胞培养液中，感染48 h后检测病毒滴度。结果显示，鱼腥草处理组能抑制病毒感染达5个log以上，即105倍以上(图3B)，提示鱼腥草水提液能直接灭活EV71病毒。综上实验结果表明，鱼腥草水提液主要通过直接灭活EV71病毒，导致病毒失活不能继续感染。

图2 12种中草药水提液抗EV71感染评估Fig.2 Evaluation of antiviral activity on EV71 by water extracts of twelve Chinese herbsNote: 1.Glyeyrrhiza uralensis Fisch；2.Gardeniu jasmionids Ellis；3.Anemarrhena asphodeloides Bunge；4.Arctium lappl L；5.Houttuynia cordata Thund；6.Forsythia suspens；7.Saposhnikovia divaricata(Trucz.) Schischk；8.Bupleurum chinense；9.Mentha haplocalyx.Briq；10.Lygodium japonicum(Thunb.)SW；11.Scutellaria baicalensis Georgi；12.Fritillaria cirrhosa,D；13.ribavirin.

图3 鱼腥草水提液能直接灭活EV71病毒颗粒Fig.3 Water extracts of Houttuynia cordata Thunb.directly inactivates EV71 viron

3 讨论

手足口病是常见的传染病，EV71是引起手足口病的主要病原，并且重症手足口病多为EV71感染所致。目前尚无有效的抗病毒药物。传统中药有抑制病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循环、镇痛抗炎等综合功效[5]。目前，中西药联合是治疗手足口病的重要手段之一。

在手足口病暴发期间，中草药被用来临床治疗手足口病，能够减轻患儿的症状，缩短病程[6]。因此，中草药在提高临床诊治水平、控制疾病发生发展中有着积极作用，展现了其独特的临床优势与特点。然而，目前并没有从实验室水平系统评估这些中草药的抗病毒作用。很多中药被推荐来治疗手足口病。我们通过筛选12种常用的中草药，发现这12种中草药中只有鱼腥草和薄荷有直接抗病毒的作用。鱼腥草具有清热解毒的功能，在民间被用来治疗痔疮、痢疾、感冒等病症。据报道，鱼腥草能够在体外抑制甲型流感病毒和单纯疱疹病毒的复制[7,8]。我们发现，鱼腥草能够直接灭活EV71病毒颗粒，从而阻断病毒感染。其他10种中草药虽然没有直接的抗病毒作用，但可能是通过其他机制，比如抗炎等，达到缓解患儿病情的作用。这一过程需要进一步证实。

需要注意的是，本实验只研究了单味中药的抗病毒作用，而临床应用的时候是混合制剂，甚至会添加一些有机物一起用于治疗手足口病。因此混合制剂既可能会增加疗效，也有可能会影响单味中药的抗病毒作用。虽然我们针对抗病毒药物的筛选做了大量工作，但对其中的有效成分抗病毒作用的机制研究、复方中各成分之间的相互作用研究仍然任重而道远。综合以上结果，本研究证实了中草药在临床治疗手足口病的有效性，为将来针对手足口病的药物研发提供理论基础。