超声波辅助提取杭白菊总黄酮工艺条件的优化

高 红，王书琪，孔晓妍，郭黎媛

（山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心，山西汾阳 032205）

杭白菊为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，亦名小汤黄、小白菊，与毫菊、滁菊、贡菊并称为中国驰名的四大名菊。杭白菊性微寒，味苦、甘，归肺、肝经，具有散风清热、平肝明目、清热解毒之功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒[1]。杭白菊的化学成分主要包括黄酮类、挥发油、三萜类、甾体类、酚类、多糖及微量元素等，药效物质基础主要为黄酮类、挥发油类成分[2]。黄酮类物质是杭白菊的主要生物活性成分之一，包括黄酮、黄酮醇和黄烷酮3 类[3]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等功能[4-5]。杭白菊总黄酮提取方法有直流回流法[6]、浸提法[7]等，本研究采用超声波辅助提取法，具有时间短、提取效率高的特点。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：杭白菊；65%vol汾酒优质大曲。

试剂：乙醇；芦丁对照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH；Rutin hydrate C 168000；Lot：80212 0.5 g 98.0 % Rcode 36137138S-code22-25）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯；蒸馏水。

仪器设备：超声波清洗器，LQ-300DE 昆山超声波仪器有限公司；紫外可见分光光度计，UV-2450 日本岛津公司；电子天平，AB204-S 梅特勒公司；容量瓶；移液管；三角瓶；烧杯；玻璃棒；量筒；滤纸；漏斗；微量进样器；胶头滴管。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

表1 超声波提取杭白菊总黄酮正交试验因素水平

1.2.1.1 芦丁标准溶液的制备

精密称取干燥至恒重的芦丁标准品7.5 mg，加入50%vol 乙醇溶解，并定容至50 mL 容量瓶中，摇匀，制成0.15 mg/mL的标准品溶液。

吸取芦丁标准品溶液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入5 %亚硝酸钠溶液0.3 mL,摇匀并静置6 min，再加入10 %氢氧化铝溶液0.3 mL，摇匀并放置6 min，最后加入4 %氢氧化钠溶液4 mL，加50%vol乙醇稀释至刻度，摇匀并放置15 min。

用另一10 mL 容量瓶在不加芦丁标准溶液的基础上重复上述加样步骤作为空白对照，在200～600 nm 波长范围内进行紫外扫描，选择最大吸收峰所在波长为后续测定波长。

1.2.1.2 芦丁标准曲线的绘制

准确量取1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL芦丁标准品溶液于10 mL容量瓶中，按1.2.1.1 方法在510 nm 波长处测定吸光度。以吸光度A 为纵坐标，芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，线性回归得到标准曲线。

1.2.2 杭白菊单因素试验

1.2.2.1 乙醇浓度的单因素试验

将杭白菊以1∶20 的比例分别浸泡在40%vol、50%vol、60%vol、70%vol、80%vol 的乙醇溶液中，24 h 后在60℃、50 Hz 下超声提取50 min，将三角瓶取出，过滤后取0.1 mL上清液测定。

1.2.2.2 料液比的单因素试验

将杭白菊分别以1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21的比例浸泡在70 %vol 的乙醇中，24 h 后在60 ℃、50 Hz 下超声提取50 min，取出三角瓶，过滤收取0.1 mL上清液测定。

1.2.2.3 提取时间的单因素试验

将杭白菊以1∶10 的比例浸泡在70 %vol 的乙醇中，在60 ℃、50 Hz下分别超声提取30 min、50 min、70 min、90 min、110 min，在不同时间将三角瓶取出，过滤取0.05 mL上清液测定。

1.2.2.4 提取温度的单因素试验

将杭白菊以1∶10 的比例浸泡于70 %vol 的乙醇中，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下提取70 min 后将三角瓶取出，过滤取0.05 mL 上清液测定。

1.2.3 杭白菊正交试验

通过以上单因素试验针对各因素分别筛选出以下范围进行4 因素3 水平的正交试验，结果见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准 曲 线：y=14.786x-0.0079，R2=0.9991。结果 见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 杭白菊单因素试验

2.2.1 乙醇浓度相关试验（图2）

如图2 所示，在乙醇浓度达到70%vol 时，杭白菊黄酮的提取量最大，这说明乙醇浓度的提高有助于杭白菊黄酮的提取，但当浓度进一步增大时，醇溶性杂质会进一步增多，反而不利于细胞内黄酮的溶出，最佳乙醇浓度选择70%vol。

图2 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

2.2.2 料液比相关试验（图3）

图3 料液比对总黄酮提取量的影响

如图3 所示，随着料液比提取出的总黄酮量持续下降，当料液比为1∶9 时提取量达到最高值；但继续增大溶剂用量至料液比为1∶21 时，提取量反而下降。表明适度增加溶剂可能有利于黄酮溶出，但过多的溶剂使黄酮的溶解量趋于饱和，从而增加杭白菊内其他醇溶性杂质的溶出。因此，根据实际生产情况确定最佳料液比为1∶10。

2.2.3 提取时间相关试验（图4）

图4 提取时间对总黄酮提取量的影响

如图4 所示，当提取时间为70 min 时，杭白菊黄酮提取量最高；当进一步延长超声作用时间，黄酮得量反而有轻微下降，原因可能是长时间的超声作用改变了超声环境，会破坏黄酮化合物的结构，因此超声时间选择70 min为宜。

2.2.4 提取温度相关试验（图5）

图5 提取温度对总黄酮提取量的影响

如图5 所示，当提取温度在30～50 ℃时，提取的总黄酮量随提取温度的升高而升高，当提取温度为50 ℃时，总黄酮提取量最大；当提取温度为60 ℃时，总黄酮提取量反而有一定幅度下降；其中在提取温度范围为30～50 ℃时，总黄酮提取量随温度上升而显著升高，说明此范围内提取温度的升高能促进超声波对杭白菊细胞结构的损坏，从而有利于总黄酮的溶出；但是当温度继续升高时，过高的温度会影响细胞内蛋白质的变性凝固，阻碍细胞中总黄酮的溶出，从而使总黄酮提取量下降。因此，确定最佳提取温度为50 ℃。

2.3 杭白菊正交试验（表2、表3）

表2 超声波提取杭白菊总黄酮正交试验表

由表3 可知，料液比对总黄酮提取的影响呈显著差异。从极差分析可以看出，影响最大的因素为料液比，影响最小的为乙醇浓度；4 个影响因素的主次顺序依次为B＞C＞D＞A，即料液比＞提取时间＞提取温度＞乙醇浓度。综合以上分析结果，确定超声波提取杭白菊总黄酮的最佳工艺条件为A3B1C3D2，即乙醇浓度70 %vol，料液比1∶10，提取时间90 min，提取温度50 ℃。

表3 杭白菊总黄酮提取正交试验方差分析表

2.4 最佳工艺验证结果

为了确认正交试验得到的优化组合条件A3B1C3D2的可靠性，进行了优化组合的验证试验以乙醇浓度70 %vol、料液比1∶10、提取时间90 min、提取温度60 ℃为提取条件进行杭白菊总黄酮提取。3 次重复后，总黄酮提取量分别为4.402 g/L、4.477 g/L、4.422 g/L，平 均 值4.434 g/L，RSD 为0.876 %，均高于正交试验中的任意组合的总黄酮超声波提取量，说明本工艺稳定可行。

3 讨论

本研究结果表明，杭白菊总黄酮超声波提取工艺的最佳条件为：乙醇浓度70%vol、料液比1∶10、提取时间90 min、提取温度60 ℃。在此提取工艺条件下，总黄酮的提取量为4.434 g/L。这一研究结果与传统浸提法相比，在缩短提取时间的同时提高了总黄酮的提取效率。