生鲜乳中黄曲霉毒素M1 液质检测方法

左英芳，马超越，张 昕，张 佳

（焦作市畜产品质量安全监测中心，河南 焦作 454003）

1 药物概述

黄曲霉毒素M1（AFM1）主要由哺乳动物食用了发霉的花生、大豆、玉米等（含有黄曲霉毒素B1）的饲料，并在其体内代谢产生。其具有强致突变性、致畸形、致癌性“三致”作用，长期摄入可诱发肝癌。故各国对乳及乳制品中的AFT M1做了严格的限定。世界多数采取两种限量，即0.05μg/kg和0.5μg/kg。中国与美国基本一致，均为0.5μg/kg；欧盟成员国相对较严格为0.05μg/kg，欧盟对特殊膳食用品则限量0.025μg/kg。

2 黄曲霉毒素M1的检测方法

2.1 原理

试样中的AFM1和13C17-AFM1用乙腈提取后离心氮吹，经Bond Elut Plexa固相萃取柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。

2.2 实验材料

2.2.1 试剂及溶液：甲醇、乙腈为色谱纯；实验用水为满足国家规定的实验室一级水；正己烷、丙酮、二氯甲烷为分析纯。

2.2.2 AFM1标准品：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。13C17-AFM1同位素溶液：0.5μg/ml。

2.2.3 仪器设备：天平：感量0.001g和0.00001g；离心机（德国Sigma），HY-3多功能振荡器（江苏金坛）；固相萃取装置；氮吹仪；液相色谱-串联质谱仪；一次性微孔滤头：0.22μm微孔滤膜；Bond Elut Plexa固相萃取柱3ml/60mg。

2.3 实验步骤

2.3.1 提取：称取5g混合均匀的试样（精确到0.001g）于50ml离心管中，加入100μL13C17-AFM1内标溶液（10ng/ml），加入15ml乙腈，涡旋振荡10min。14000r/min离心5min，取上清液10ml于离心管中，置于50℃水浴中吹至2ml以下，待净化。

2.3.2 净化：依次用3.5ml甲醇、3.5ml水活化Bond Elut Plexa固相萃取柱。上样，加3.5ml水淋洗，抽干，加3.5ml正己烷淋洗（除脂），抽干。用20%丙酮二氯甲烷溶液4ml洗脱，收集洗脱液于离心管中。

2.3.3 复溶：洗脱液于50℃水浴下用氮气吹干，残余物用10%乙腈溶液0.5ml溶解，涡旋混匀，取上清液过0.22μm滤膜，用高效液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。

2.4 液相及质谱条件

2.4.1 液相色谱条件：液相色谱柱：Acquity UPLC BEHC18（1.7μm，2.1mm×50mm）。柱温：35℃。流动相：A：乙腈；B：水。进样量：5μl。

梯度洗脱如下：

时间（min） 流速（ml/min） A% B% 曲线类型/0.3 10 90 /3.00 0.3 35 65 6 4.00 0.3 90 10 6 5.00 0.3 10 90 1

2.4.2 质谱参考条件：毛细管电压：3.00 kV；萃取补偿电压：44V；源温：150℃；雾化温度：450℃；雾化气流速：1000 L/hr。

质谱参数如下：

药物名称 离子源 定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）锥孔电压（V）碰撞能量（eV）AFM1 ESI+329.09＞229.13 329.09＞259.00 329.09＞273.11 329.09＞229.13 48 38 20 13C17- AFM1 ESI+ 346.20＞288.21 346.20＞272.93 346.20＞272.93 16 2224

3 特点对比

本实验采用了Bond Elut Plexa固相萃取柱替代免疫亲和柱，现就两种方法的优劣进行比较如下：

（1）提取溶剂由国标的甲醇改变为乙腈。过柱液体也由国标的40ml变为现在的3ml，极大的节约了过柱的时间成本。

（2）免疫亲和柱的储存条件要求在4℃的条件下冷藏保存，相对只需常温保存的固相萃取柱而言条件十分苛刻。且免疫亲和柱的成本极高，改变条件后极大的节约了样品的检测成本。

（3）净化液类型上增加了正己烷和20%丙酮-二氯甲烷，由于该两种物质有较强的毒副作用和环境污染，故要求实验人员做好相应的保护措施和废液处理措施。

（4）免疫亲和柱的选择性较高，在色谱图的响应高。Bond Elut Plexa固相萃取选择性低，在色谱图的响应较低，但可以满足国标上的检测定量要求。

4 总结

本实验方法是基于实验室有大批量样品时，为尽快处理样品并节约检测成本的情况下，进行的实验方法改善。本实验方法也有选择性低、响应性低等不足之处，在今后的实验过程中希望完善不足之处。