基于文献的气滞血瘀证差异表达谱生物信息学研究＊

何浩强，陈 光，高嘉良，胡 坤，刘 超，王 阶＊＊

（1.中国中医科学院广安门医院心血管科 北京 100053；2.北京中医药大学研究生院 北京 100029）

证候的生物学基础研究是中医客观化研究的关键部分，几十年来，学者从整体、细胞、分子等多个层面做了相关探索。随着后基因组时代的到来，证候生物学基础研究在基因层面找到新的方向。借用基因芯片、基因测序等技术，筛查与证候相关的基因差异表达谱，并通过已有的基因注释信息，对差异表达谱进行生物信息学分析以探索与证候发生相关的生物功能或信号通路，从而为揭示证候的发生机制提供理论支持[1]。气滞血瘀证是中医临床常见证候之一，现有研究已发现其与微循环障碍、血液流变学改变、炎症、凝血-纤溶系统失衡、内皮功能障碍、免疫功能紊乱等病理改变相关，另外，气滞血瘀证研究在组学层面也取得一定进展，但尚未完全阐明气滞血瘀证发生机制，同时，对于不同研究得到的差异结果，未建立起气滞血瘀证基因数据库。因此，本文通过查找气滞血瘀证组学研究相关文献，梳理归纳现有研究结果，并运用生物信息学方法对基因差异表达谱进行综合分析，以期为气滞血瘀证组学研究提供新的思路。

1 材料

1.1 文献检索

在中国知网——《中国学术期刊（网络版）》和PubMed 数据库中以“气滞血瘀证、气滞血瘀、血瘀气滞、基因、DNA、RNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA”以及相应英文为检索词，检索时间限定为建库至2018年2 月，检索气滞血瘀证组学层面研究的相关文献。将检索得到的文献根据以下纳入/排除标准进行筛选。

1.2 诊断标准

气滞血瘀证诊断标准参照《中医证候鉴别诊断学》[2]、《中药新药临床研究指导原则(试行)》[3]中相关的气滞血瘀证诊断标准。

1.3 文献纳入标准

1.3.1 气滞血瘀证诊断标准

符合研究证型符合气滞血瘀证诊断标准的文献均可纳入。

1.3.2 文献类型

临床试验、动物实验、细胞实验等研究类文献均可纳入。

1.3.3 研究技术

研究采用基因芯片、测序技术、qRT-PCR、免疫组化等技术检测均可纳入。

1.3.4 研究指标

DNA、RNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA 等组学指标均可纳入。

1.4 文献排除标准

排除：①气滞血瘀证非主要研究证型或研究结果与气滞血阻证无关的文献；②综述类文献；③研究内容重复文献。

2 方法

2.1 文献资料提取与统计分析

使用Excel2010 进行文献资料的基本信息与组学信息提取。

2.2 基因形式统一

分别利用NCBI 基因数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），miRBase（http://www.mirbase.org/），LNCipedia（https://lncipedia.org/），circBase（http://www.circbase.org/cgi-bin/listsearch.cgi）将从文献提取的气滞血瘀证DNA、mRNA、Protein、miRNA、lncRNA、circRNA 统一为Gene symbol的形式。

2.3 基因功能富集与信号通路分析

利用The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery（DAVID）平台（https://david.ncifcrf.gov/）中的GeneOntology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库对气滞血瘀证基因进行功能富集与信号通路分析。在“upload gene list”（基因列表载入）框输入Gene symbol 形式的气滞血瘀证基因，在"Identifier"（基因识别）点击"OFFICIAL_GENE_SYMBOL"选项，在"List Type"（列表类型）勾选"Gene List"（基因列表），再点击SubmitList"（提交基因列表），在下一界面中的"Gene List Manager"（基因列表管理）栏目下，“Species”（物种）选择“Homo Sapiens”（人类），再点击“Use”。显示分析结果，将GO 基因富集和KEGG信号通路分析结果导出。

2.4 基因相互作用网络分析

利用starBase v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）平台中的miRNA-target interactions 模块（预测miRNA与靶基因关系网络）、miRNA-lncRNA interactions模块（预测miRNA 与lncRNA 关系网络）、miRNAcircRNA interactions（预测miRNA 与circRNA 关系网络）与STRING Version 10.5(https://string-db.org/)平台中的Multiple proteins 模块建立气滞血瘀证ceRNAmRNA-protein相互作用网络，并进行可视化展示。

3 结果

3.1 文献检索结果

本次共检索出气滞血瘀证相关文献331 篇，通过阅读篇名、摘要以及全文对文献进行综合筛选，最终纳入41篇文献。其中国内期刊文献38篇，国外期刊文献3篇。41项纳入文献的基本信息（表1）。

3.2 基本资料分析

纳入的41项研究中涉及的病种范围较为广泛，其中冠心病心绞痛3项，心肌梗死1项，急性冠脉综合征1项，高血压5项，闭塞性动脉硬化症3项，胃癌6项，大肠癌2项，乳腺癌1项，肝癌1项，肺癌1项，高脂血症3项，糖尿病2 项，肝纤维化3 项，溃疡性结肠炎1 项，子宫内膜异位症3项，单纯证候研究6项。将疾病按照临床科属归类，可大致分为5类，其中心血管病领域研究最多，占31%，其次为癌症，占26%，代谢性疾病占12%，消化系统疾病占10%，妇科疾病占7%。这一病种研究分布情况与现代医学在疾病组学研究的方向基本一致，同时，也提示气滞血瘀证在临床分布广泛，为常见证候。

表1 41项纳入文献的基本信息

3.3 组学研究分析

纳入的41 项研究中，蛋白表达研究数量最多，有16 项，其次为mRNA 研究，有8 项，SNP 研究7 项，miRNA 研 究5 项，DNA 甲 基 化 研 究4 项，lncRNA 和circRNA 研究各1 项。从年份分布来看，2011 年以前，气滞血瘀证组学研究以蛋白表达、mRNA和SNP为主，2011 年以后，研究丰富了DNA 甲基化以及ncRNA 的内容，提示气滞血瘀证候组学研究的逐步深入以及与科学前沿接轨。气滞血瘀证已知基因组、转录组研究结果总结如下，（表2）。

表2 气滞血瘀证已知基因、转录组研究数据总结表

表3 气滞血瘀证基因生物过程分析

3.4 基因GO功能富集

3.4.1 生物过程(biological process，BP)分析结果

通过DAVID 平台，对气滞血瘀证相关基因进行GO富集BP分析，将基因富集数≥3的项目总结（表3）。

3.4.2 细胞组成(cellular component，CC)分析结果

通过DAVID 平台，对气滞血瘀证相关基因进行GO富集CC分析，将基因富集数≥3项目总结（表4）。

3.4.3 分子功能(Molecular Function，MF)分析结果

通过DAVID 平台，对气滞血瘀证相关基因进行GO富集MF分析，将基因富集数≥3项目总结（表5）。

分别将BP、CC和MF分析结果中，基因富集数目≥2，且富集得分（-log10Pvalue）排名前10的GO项目总结（图1）。根据GO 分析结果可知，在生物过程方面，气滞血瘀证相关基因主要与细胞对环状化合物的反应（cellular response to organic cyclic compound）、对转录、神经元凋亡基因表达的负性调控（negative regulation of gene expression）以及炎症反应（inflammatory response）相关；在细胞组成方面，气滞血瘀证相关基因主要与蛋白复合物（protein complex）、核质（nucleoplasm）、细胞表面（cell surface）相关；在分子功能方面，气滞血瘀证相关基因主要与可识别蛋白结合（identical protein binding）、酶结合（enzyme binding）、转录调控区域的基因结合（transcription regulatory region DNA binding）相关。其中炎症反应与目前气滞血瘀证生物学基础研究联系最为密切。

3.5 基因KEGG信号通路分析

通过DAVID 平台，对气滞血瘀证相关基因进行KEGG 信号通路富集分析，将基因富集数≥3 项目总结（表6）。根据KEGG分析结果可知，与气滞血瘀证相关

基因可能有关的信号通路包括肿瘤相关蛋白多糖（hsa05205：Proteoglycans in cancer）、肿瘤坏死因子信号通路（hsa04668：TNF signaling pathway）、肿瘤相关信号通路（hsa05200：Pathways in cancer）、人类T 淋巴细胞病毒感染（hsa05166：HTLV-I infection），其中肿瘤坏死因子信号通路与目前气滞血瘀证生物学基础研究联系较为密切。

表4 气滞血瘀证基因细胞组成分析

表5 气滞血瘀证基因分子功能分析

图1 气滞血瘀证相关基因GO富集条目（Top 10）

表6 气滞血瘀证相关基因信号通路富集

4 讨论

通过生物信息学方法，分别对气滞血瘀证相关基因进行功能注释、GO 功能富集分析、KEGG 信号通路分析以及miRNA-mRNA-protein 相互作用网络分析，我们发现目前研究已知的气滞血瘀证相关基因生物学功能相当广泛，主要分为蛋白编码与转录后调控两部分，其中前者编码的蛋白种类丰富、功能多样，后者对靶基因表达的调控也有上调与下调的区别。GO 功能富集分析结果显示，相关基因参与转录和神经元凋亡调控、炎症反应、细胞增殖等生物过程，核质、细胞膜、外泌体等细胞组成，具有蛋白结合、酶结合、基因结合等分子功能，其中参与炎症反应过程与目前气滞血瘀证生物学基础研究联系较紧密。KEGG信号通路分析结果显示，相关RNA 主要与肿瘤相关蛋白多糖、肿瘤坏死因子、肿瘤和人类T 淋巴细胞病毒感染等多条信号通路有关，其中TNF 信号通路与气滞血瘀证生物学基础研究关系密切。

在临床上，炎症局部常表现为红、肿、热、痛，很多中医临床学者认为其应归属于中医“热毒”的范畴。实际上，炎症与气滞血瘀的关系同样紧密，原因包括以下几点：①临床表现，炎症局部的肿胀，疼痛，按时加重与气滞血瘀临床症状基本一致；②病理变化，炎症介质诱导的血栓形成、血管内皮损伤，局部瘀血，微循环障碍，流变学改变与气滞血瘀的病机十分相似；③发病原因，情绪激动、压力紧张，应激状态是炎症的诱因，同样也是气滞血瘀证的诱因，正如《灵枢·百病始生》提及：“若内伤于忧怒则气上逆，气上逆则六输不通，凝血蕴里不散”。

现代研究也表明，在急性冠脉综合征、高脂血症气滞血瘀证患者中存在高敏C反应蛋白、白细胞介素-6、细胞间黏附分子-1、TNF-α等炎症因子水平升高的表现[45-47]。动物实验发现，气滞血瘀证大鼠白细胞介素-6水平异常[48]，血瘀证家兔模型中TNF-α水平在造模后明显升高[49]，经活血化瘀药物干预后，二者水平下降，侧面反映了炎症与气滞血瘀证的内在联系。

另外，通过靶基因预测、蛋白作用网络及拓扑分析初步构建气滞血瘀证miRNA-mRNA-protein 相互作用关系网络，由于受到目前研究数量的限制，并未在已知mRNA、miRNA 找到调控关系，而是通过已知miRNA靶基因预测寻找关键mRNA，并与关键mRNA 编码蛋白相互作用关系构建调控网络，虽然无法完全体现气滞血瘀证相关RNA内部调控关系，但从方法学上对调控网络构建提供了参考。

综上，气滞血瘀证相关基因涉及多功能、多通路，其中与炎症反应与肿瘤坏死因子信号通路联系最为密切，上述分析结果可为气滞血瘀证生物学基础研究带来一些参考性的启发，但更具体的生物学基础与发生机制仍待进一步探明。