基于实体语法系统研究中药治疗乳腺癌的分子调控网络＊

雷巧灵，侯旭灿，贾聪敏，李 梦，王 耘

（北京中医药大学中药学院 北京 102488）

乳腺癌是中国常见女性恶性肿瘤之一，在中国每年被诊断为乳腺癌和死于乳腺癌的人数也在逐年增加[1]，阐明乳腺癌的分子生物学机制已成为重要的转化医学研究之一，但是乳腺癌的发病机制复杂，包括基因突变、遗传因素、神经功能异常等[2]。很多研究认为基因突变是乳腺癌发生的主要特征[3]，基因的突变积累会进一步影响与乳腺癌发生发展密切相关的信号通路，包括原癌基因，抑癌基因以及与DNA 损伤与修复相关的基因。在乳腺癌的发生发展中，癌症相关基因的关系组成一个复杂的相互调控的动态网络过程[4]，分子调控网络中每个基因或蛋白质的变化都可能会直接或者间接影响细胞周期，增殖和凋亡等生物学过程。随着生物信息学的发展，积累了大量的基因或蛋白之间的相互调控数据，因此从疾病分子调控网络角度对乳腺癌等复杂疾病进行分析有助于进一步阐明乳腺癌的发病机制。

相较于现代医学，中药治疗乳腺癌具有一定优势，但是中药多成分，多靶点的特点，使其在治疗乳腺癌等复杂疾病上存在作用机制不清楚等局限性，由于乳腺癌的发病机制也十分复杂，使中药在治疗乳腺癌的过程中所产生的具体作用更加难以明确。

本研究基于数据库收集乳腺癌相关基因或蛋白质调控信息构建乳腺癌分子调控网络，并利用本实验室建立的实体语法系统[5-7]，结合乳腺癌分子调控网络，化合物及靶点数据，分别构建黄芪、茯苓、白花蛇舌草以及柴胡治疗乳腺癌的分子作用网络图，以推断药物作用靶点与疾病相关靶点之间的作用关系，从而对这4 味中药进行作用机制研究，为中药通过组分配伍的新药开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 乳腺癌分子调控网络的构建及分析

DISNOR[8]是一个有关疾病基因调控网络的数据库，主要是利用DisGeNET 的基因-疾病关联数据，SIGNOR 中标注的与疾病基因相关的交互作用信息和mentha 中蛋白相互作用数据生成疾病基因的调控网络，目前该数据库收集超过3 700 个疾病相关网络。CIDeR[9]主要是从科学文献中提取经过实验验证的疾病相关分子之间的相互作用信息的一个人工管理数据库，目前该数据库已通过检索1 912个出版物，收集了18 813种疾病相关的相互作用关系。本研究通过检索“乳腺癌”等关键词，并使作用对象为基因或蛋白质，作用类型为抑制或激活，在DISNOR 和CIDeR 数据库中分别收集了124 及674 条调控关系。汇集并去除重复关系获得219个分子，403条调控关系，而后在PubMed文献检索验证的基础下，获得包含228个分子及498条调控关系的乳腺癌分子调控网络。

1.2 治疗乳腺癌的中药及活性成分筛选

中医在临床上治疗乳腺癌常用扶正固本法、利水渗湿法、清热解毒法以及疏肝理气法的处方治法，其中治疗乳腺癌的处方大部分采用四法联用[13]。本研究按照中医治疗乳腺癌的四法治则，并基于临床上常用中药为标准，选择了黄芪、茯苓、白花蛇舌草以及柴胡4味中药。黄芪，临床上用于补虚的代表药，明《本草纲目》载有“为补者之长故名”。并且有研究发现黄芪注射液能有效阻滞乳腺癌MCF-7细胞的增殖[14]。茯苓属于利水渗湿常用药，桂枝茯苓丸为妇人癥瘕之专方，且茯苓酸能抑制MDA-MB-231 细胞的增殖并诱导其凋亡[15]。白花蛇舌草有清热解毒的功效，有动物实验证明白花蛇舌草的提取物能抑制乳腺癌的发展[16]。柴胡可疏肝解郁，中医认为肝失疏泄为乳腺癌的主要病机，柴胡疏肝散是治疗乳腺癌的常用方剂，且有研究证明柴胡疏肝散能显著提高化疗药物对肺转移乳腺癌的疗效[17]。所以本研究最终选择了这4种代表药进行研究然后通过TcmSP数据库[18]收集每一味中药的化学成分。

获得4 味中药的全部化学成分后，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和类药性（Drug-Like，DL）来筛选中药的活性成分[19]。OB是表示到达体循环的口服施用剂量的未改变药物的百分比，评价药物能否发挥药效的关键指标，DL代表中药成分与已知西药的相似性，用于估计预期化合物的“药物样”。本研究按TCMSP 建议的筛选标准以OB 的筛选标和DL 的筛选标准作为活性成分筛选条件。

1.3 中药调控乳腺癌相关基因的解析

实体语法系统（entity grammar systems）是一种形式语法系统[6,7]，拓展于Chomsky生成语法系统，已利用其进行多项中药作用机制的解析[5,20]，具有高效灵活等特点，适用于针对复杂生物系统的研究。

实体语法系统可以用G=(VN,VT,F,P,S)的数组形式表示，其中VN代表非末端字符集、VT为末端字符集、F 代表操作子集、P 和S 分别代表规则集和初始字符。在无需区别VN与VT时有V=VN∪VT。在本研究中V 代表网络中各种类型的节点，包括中药、中药化学成分、化学成分作用靶点、疾病相关靶点等。F代表这些元素之间的关系，如interaction。P 类似于推理的公式，基于V 和F 所构成的结构单元实体进行推理，如实体1 为（A，B，interaction），实体2 为（B，C，interaction），那么可推出（A，C，interaction）。据此推断A对C有间接调节作用，且A对C的作用距离为两实体的作用距离之和。S 则对应于系统的初始状态，本研究中的数据应用形式draw（A，B，C，D），可描述为源节点A 和靶点B 的作用方式为C（interaction），且作用距离为D 步，D 步为网络中节点与节点之间关系推算的传递步数之和。

将筛选出的活性成分，通过STITCH数据库[21]查找其作用靶点，并利用TTD 数据库[22]收集乳腺癌相关靶点，以及基于数据库所构建的乳腺癌分子调控网络，利用实体语法系统构建中药成分作用于乳腺癌相关靶点的分子作用网络，通过推断分子间相关作用，并利用DAVID对成分作用的疾病相关靶点进行富集分析，然后对所选中药治疗乳腺癌的作用机制进行解析并利用Cytoscape进行可视化。

2 结果与讨论

2.1 乳腺癌分子调控网络的构建及分析

我们利用数据库及文献检索收集了228个基因或蛋白质及498个调控关系。其中发现有15个节点与主网络无关联，提示上述节点可能对整个网络无影响，故剔除。最终构建包含213个节点，486条关系的调控网络（图1）。

网络涉及多种信号通路，如TP53信号通路、PI3KAKT 信号通路、ATR/ATM 信号通路、WNT 信号通路、TNF 信号通路、mTOR 信号通路以及MAPK 信号通路，这些信号通路在肿瘤的发生发展中扮演重要的角色，如DNA损伤可导致肿瘤的生长[23]，DNA损伤的反应机制包括P53 肿瘤抑制因子及ATR/ATM，P53 可通过对Bax与Fas的转录激活，Bcl2的表达抑制来促进细胞凋亡[24-27]。ATR/ATM 信号通路在决定细胞对DNA 损伤信号的反应中起着关键作用，如ATR识别DNA损伤所引起的DNA 单链断裂，并激活CHEK1 以启动细胞周期停滞和DNA 复制抑制，抑制细胞周期蛋白[28]。而ATM-CHEK2 则是被DNA 双链所激活，从而使细胞周期停滞[29]。另一方面PI3K/AKT，TGF-beta和TNF-alpha信号通路与细胞的生长或死亡相关。TGF-beta 以抗增殖作用而闻名，在很多晚期肿瘤中，TGF-beta 信号从抑制细胞增殖转向激活细胞程序，这种变化被称为上皮-间充质转化（EMT），一旦发生这种转变，就会赋予恶性肿瘤有关的癌细胞特征[30]。PI3K/AKT/mTOR信号通路则是通过生存信号的刺激来阻断细胞凋亡，当生存信号不足，PI3K 信号通路下调，即可诱导细胞凋亡[31]。Wnt 通路调控细胞的粘附和迁移[32]。所构建的乳腺癌分子调控网络包括核心信号网络，因此足够用于研究复杂的生物过程。

2.2 中药及活性成分筛选

笔者对4味中药及通过口服生物利用度及类药性进行筛选的活性成分进行了统计（表1）。由结果可得通过筛选，黄芪所得活性成分有20种，茯苓为15种、白花蛇舌草为7种、柴胡有17种，其中黄芪、白花蛇舌草、柴胡共有的抗肿瘤成分为槲皮素，山奈酚等，茯苓的抗肿瘤成分为茯苓酸等。

2.3 中药调控乳腺癌相关基因解析

2.3.1 4 味中药有效成分作用靶点与乳腺癌相关基因的作用关系网络

本研究利用实体语法系统对所筛选出的活性成分进行作用机理解析。从中药化学成分对乳腺癌相关基因作用的角度分析这些中药治疗乳腺癌的方式。筛选的中药化学成分对乳腺癌相关基因的分子作用网络图（图2），其中A、B、C、D 分别是黄芪、茯苓、白花蛇舌草以及柴胡中的活性成分通过一步或多步对乳腺癌相关基因的调控。其中不同的节点形状代表不同的类型。

图1 乳腺癌分子调控网络图

表1 中药及活性成分统计表

分析结果可知，黄芪中有16个成分经过多步作用最终作用于15 个乳腺癌相关靶点，其中ESR1、AR、PGR、CA2、HSP90AA1、PIK3CG、KDR、INSR、BCL2、PLAU、EGFR 为黄芪中化学成分的直接作用靶点。茯苓所含的13个化学成分会作用于乳腺癌相关靶点，其中AR、PGR、ESR1、CA2 为直接作用靶点。白花蛇舌草中6个化学成分经过多步作用最终作用于14个乳腺癌相关靶点，其中AR、PGR、ESR1、CA2、HSP90AA1、PIK3CG、PLAU、EGFR、INSR、BCL2 为直接作用靶点。柴胡中所含的13 个化学成分经过多步作用最终作用于14 个乳腺癌相关靶点，而AR、PGR、ESR1、CA2、HSP90AA1、PIK3CG、PLAU、EGFR、INSR、BCL2为直接作用靶点。4 味中药作用最终作用于乳腺癌相关靶点结果如表2 所示，表中所标记靶点为中药直接作用靶点。

由此结果可知4味中药联合使用则最终都会作用于ESR1、AR、BCL2、PGR、ERBB2、SRC、PIK3CA、CA2、EGFR、HSP90AA1、PIK3CG、KDR、INSR、PLAU、TFF1 15 个乳腺癌相关靶点。对这些疾病靶点进行富集分析表3所示，基因富集到“示，基因富信号通路”、“信号转导”以及“细胞增殖的正调节”、“细胞迁移的正调节”等与肿瘤发生发展有密切关系的功能，也可以得知这4 味中药是通过多种化学成分经过多靶点、多途径最终作用于多个疾病靶点来达到治疗乳腺癌的目的。

2.3.2 4味中药作用于乳腺癌子网络分析

由于整体网络较为复杂，因此文章将通过提取子网络的方法对药物成分作用靶点与疾病靶点间的关系进行解析。由于黄芪、白花蛇舌草以及柴胡都含有槲皮素这一成分，黄芪和柴胡都含有山奈酚，且这两成分都被证明具有抗肿瘤作用[33,34]，茯苓中的茯苓酸被证明有抗肿瘤的作用[15]，故对槲皮素、山奈酚、以及茯苓酸治疗乳腺癌的作用机制进行解析，所提取的槲皮素、山奈酚、茯苓酸通过疾病靶点作用于乳腺癌的通路（图3A、图3B、图3C）。

PTGS2 编码COX-2 酶，其参与癌症的发生，抑制免疫应答以及细胞凋亡，可能促进血管生成和肿瘤细胞侵袭和转移，缺氧或者炎症因子等因素会促进PTGS2的表达[35]。TNF，即肿瘤坏死因子，是一种多功能促炎细胞因子，在乳腺癌中高表达，并且参与多种生物过程的调控，包括细胞增殖，凋亡以及脂质代谢等。炎症在乳腺癌发病机理中起主要作用，有研究证明肿瘤坏死因子的肿瘤促进功能可能是其具有诱导促血管生成，细胞黏附分子的表达以及诱导DNA 损伤的能力[36]。EGFR，是著名的乳腺癌分子靶标，EGFR 在大部分三阴性乳腺癌和炎性乳腺癌中都过度表达，有研究证明EGFR 的过表达可促进上皮-间质转化（EMT）[37]。AKT1，也称为蛋白激酶B（PKB），在人类癌症中经常过度表达，是PI3K 下游的主要效应分子，其参与细胞内的代谢，生存和生长等多种生物学过程。AKT1在乳腺癌进展中的特异性作用主要分为两方面：一是有研究证明下调AKT1的表达能明显促进肿瘤细胞的迁移能力，二是抑制AKT1 的表达能显著抑制乳腺癌细胞的增殖[38,39]。

图2 中药成分调节乳腺癌相关靶点的生物分子作用网络

表2 四味中药作用于乳腺癌相关靶点

槲皮素对TNF、PTGS2、EGFR 均有负向调控作用[40-42]，而TNF被证实有促进AKT1表达的作用[43]，在乳腺癌肿瘤相关巨噬细胞中COX-2 的过表达会促进PI3K/Akt 通路的激活[44]。mTOR是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其位于PI3K 和Akt 的下游，PI3K/AKT/mTOR 信号通路是肿瘤进展的关键介质，当PI3K信号传导激活AKT 则会导致mTOR 的活化[45]。而PPP2CA 则是编码磷酸酶2A 催化亚基。其参与了细胞生长和分裂的负调控。大量研究强调了PP2A 作为肿瘤抑制因子的作用，并提示PP2A失活可能有助于癌症的发展，活化的mTOR可使PP2A磷酸化并抑制其活性[46]。SRC是一种非受体酪氨酸激酶，定位于细胞的细胞内膜，被发现在乳腺癌等许多人类肿瘤中过表达，Src的过度表达在调节肿瘤血管生成、细胞增殖、迁移及侵袭等方面起重要作用，EGFR可通过磷酸化激活SRC[47]，而PP2A可以抑制SRC的活性[48]。

表3 疾病靶点富集分析结果图

综上所述，槲皮素具有的抗肿瘤作用一方面可通过抑制PTGS2 或TNF，再经由AKT-mTOR-PP2A 途径达到抑制乳腺癌靶点SRC 的目的，另一方面槲皮素可抑制EGFR的活性，从而减弱促进SRC表达的能力。

山奈酚对Bcl-2、GSK3B 以及TNF 具有抑制作用[34,49,50]，GSK3B（糖原合成激酶3β），对多种恶性肿瘤的发生、增殖、凋亡等方面起到调控作用[51]。PTEN 是生长因子信号传导的关键调节因子，而且PTEN 的丢失被证明与乳腺癌有关，另外PTEN 的肿瘤抑制功能独立于磷酸肌醇脂质磷酸酶活性并在细胞周期调节，维持基因组不稳定性和控制DNA 修复机制中起关键作用，其保护细胞免于基因突变的累积和不受控制的增殖，PTEN 丧失使这些基因组保护机制失调，并且还导致AKT1活化，促进肿瘤发生[52]。GSK3B通过磷酸化PTEN的Ser-362和Thr-366位点而使其磷酸酶活性降低[53]。BCL2 编码Bcl-2，在Bcl-2 家族起抗调亡作用，Bcl-2在乳腺癌中过表达，属于癌基因，其表达的上调是生长因子促进细胞存活的关键机制[54]。目前有针对靶向抑制抗凋亡Bcl-2 的药物，或者是将其与化合疗法联用以增加对肿瘤细胞的杀伤力。另外Akt可以通过磷酸化失活Bad 和通过转录激活上调Bcl-2 来促进细胞存活[55]。

所以，根据对山奈酚作用于乳腺癌相关靶点Bcl-2的解析可知，一方面通过抑制TNF 及GSK3B，再经由PTEN/AKT1 达到弱化Bcl-2 活性的目的，另一方面山奈酚有直接抑制Bcl-2的作用，通过以上途径，山奈酚抑制了Bcl-2的表达，以促进乳腺癌细胞凋亡。

图3 槲皮素（A）、山奈酚（B）、茯苓酸（C）通过疾病靶点作用于乳腺癌的通路图

茯苓酸具有的抗肿瘤作用，表现为直接作用于乳腺癌相关靶点AR 而达到治疗乳腺癌的目的。而AR是一种新兴的乳腺癌激素靶点，AR 在60-70%的乳腺肿瘤中表达，有研究证明有大量的ER-/HER2+乳腺肿瘤表达AR，进而刺激肿瘤细胞的生长，而在此类细胞中，针对ER信号通路的内分泌治疗可能无效，故针对AR为靶点是ER-/HER2+乳腺肿瘤的潜在治疗方法[56]。

3 结论

中医在临床上治疗乳腺癌的处方大都采用四法联用，但中药治疗乳腺癌的机制复杂且难以明确。故本研究选择四法联用的代表药，基于现有数据库，并结合文献验证，构建乳腺癌分子调控网络，并按照中药-中药化学成分-化学成分作用靶点-分子调控网络-疾病相关靶点这一完整的生物学过程建立了分子生物网络，在分子水平上系统解析所筛选的4 味中药治疗乳腺癌的作用机制。结果表明，4 味中药中有48 个化学成分会直接或间接的作用于15个乳腺癌相关靶点，从网络的总体特征以及针对4味中药中的抗肿瘤成分作用途径解析，这4 味中药都存在一个化学成分作用于一个疾病相关靶点的现象。而且可能通过PI3K-Akt信号通路，EGFR 信号通路等多种途径作用于多个疾病靶点，引起细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，降低癌细胞侵袭和转移能力以及促进细胞凋亡从而起到治疗乳腺癌的作用。

本研究利用生物信息学，并整合网络药理学方面的知识，尝试从分子水平上系统地解析常用于治疗乳腺癌的中药，通过作用乳腺癌相关靶点从而治疗乳腺癌的作用机制，这为配伍有效成分治疗乳腺癌提供了线索和依据，并对药物研发具有一定指导意义。