经木香烃内酯诱导的骨髓间充质干细胞用于治疗脑缺血再灌注损伤的研究＊

江 羽，王叶叶，梁 晨，谭 睿,2＊＊

（1.西南交通大学医学院 成都 610031；2.西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031）

缺血性脑卒中现在仍是危害人类性命的重大疾病之一，其发病率、致残率及死亡率都极高[1]，由于该疾病的复杂性及神经修复的困难性，至今仍缺乏有效的治疗与预后手段[2]。现有如抗炎、抗氧化等多种治疗方案被报道，但在临床治疗效果评价中，均未取得显著性突破[3]。令人欣喜的是，干细胞用于心脑血管疾病治疗成为新的研究热点，也为脑缺血的治疗提供了新的方向。其中，骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，bMSCs)是一种来源于骨髓基质系统中的非造血组织干细胞，具有较强的增殖能力且有多向分化潜能，在特定的理化环境或一些细胞因子的诱导下可以向神经系细胞（如神经元细胞、星形胶质细胞等）分化[4,5]，且bMSCs易获取、易在体外培养，具有较强的增殖能力，因此常被用于干细胞分化与治疗研究[6]。目前最常用于诱导bMSCs 分化为神经样细胞的物质是β-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）[7,8]，其中，bFGF 来源少且价格昂贵，而β-巯基乙醇易引起细胞死亡且诱导成功后维持时间较短[9]，因此需进一步研发新型药物分子用于干细胞治疗。中药单体来源广泛，提取便利，其药理效果越来越受到重视[10]。木香烃内酯是中药木香的主要有效成分，是一种倍半萜内酯类化合物，主要有抗炎、抗肿瘤[11]等作用。有研究证明，木香烃内酯可通过提高Bcl-2 的表达量、降低Bax的表达量[12]及激活Keap1-Nrf2-ARE 通路诱导大量抗氧化分子的表达[13]达到神经保护的作用。同时，神经保护的另一重要机制是促进神经修复与再生，而诱导干细胞分化正是神经再生的途径之一[14]，因此考虑木香烃内酯是否有促进bMSCs 分化为神经样细胞的作用。本实验用木香烃内酯作为诱导剂，体外检测其对bMSCs 向神经样细胞分化的诱导效果，进一步通过诱导分化后bMSCs 对脑缺血再灌注损伤大鼠模型的治疗作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及仪器

胎牛血清（gibco，批号：1908121）；DMEM 低糖培养基（Hyclone，批号：J180003）；胰蛋白酶（Hyclone，批号：J180003）；四甲基偶氮唑盐（MTT）（锐赛生物公司，批号：180315）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（源叶生物科技有限公司，批号：BCBR5460V）；4%多聚甲醛（Biosharp，批号：180119）；96 孔板（Thermo，批号：167008）；苏木素染液套装（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：G1005）；NESTIN 一抗（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：GB12137）；GFAP一抗（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：GB11096）；NSE 一抗（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：GB11376-1）；二抗CY3山羊抗小鼠（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：GB21301）；二抗488 山羊抗兔（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：GB25303）；二抗CY3山羊抗兔（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：GB21303）。

1.1.2 实验动物

SPF 级成年雄性SD 大鼠40 只，平均体质量在280-300 g，用于制备脑缺血再灌注动物模型；SPF 级2-4 周龄雄性SD 大鼠2 只，平均体质量在120-140 g，用于制备骨髓间充质干细胞。

1.2 试验方法

1.2.1 bMSCs的分离、培养

选取2-4周龄健康雄性SD大鼠脱颈处死，将全身浸入75%乙醇中消毒约10 min。在无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪去两端骨骺，用5 mL 注射器抽取5 mL 含15%胎牛血清的DMEM 完全培养基先自一端冲出骨髓，再从另一端冲洗，制成单细胞悬液，置于10 mL培养皿中，放置于37℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度培养箱中，24 h 后全量换液，以后每2 天换液1次，去除非贴壁细胞。每日观察细胞的生长情况，待原代细胞融合达到80%-90%时，按1∶3 比例进行传代，并将培养基更换为含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基。经多次传代扩增培养，使骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。

1.2.2 木香烃内酯对bMSCs毒性检测

通过MTT 检测木香烃内酯对bMSCs 的毒性。取第三代bMSCs，按照每孔1.0×104个细胞接种于96 孔板中，放置于培养箱中24 h使其贴壁。设置木香烃内酯的浓度梯度为2 μM，5 μM，10 μM，20 μM，40 μM，60 μM，80 μM，并按分组加入相应浓度药物，置于培养箱中培养24 h。培养结束后，每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μl，避光培养2 h 后吸出培养基，每孔加入100 μl DMSO，充分震荡后使用酶标仪检测吸光度，波长为570 nm，记录结果，以药物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制bMSCs生存曲线。

1.2.3 木香烃内酯诱导bMSCs向神经样细胞分化

选择第3代bMSCs，按照每孔1.0×105个细胞接种于6 孔板，放置于培养箱中培养24 h 使其贴壁。根据MTT 结果，选择浓度为10 μM 的木香烃内酯溶液对bMSCs进行诱导，根据时间设置4 h，12 h，24 h共3组，定时观察细胞形态变化，并对其进行骨架染色。将诱导结束后的细胞固定，封片，通过免疫荧光染色的方法对其NSE，GFAP及Nestin三种神经细胞标志蛋白的表达量变化进行检测。

1.2.4 脑缺血再灌注动物模型制备

将40 只大鼠随机平均分为假手术组，模型组，MSC 组及木香烃内酯诱导MSC 组（诱导组）（n=10）。使用改良Zea Longa's 线栓法制作大脑中动脉闭塞（MCAO）局灶性脑缺血模型[15]。具体步骤为：以体积分数10%的水合氯醛溶液按0.33-0.36 mL·100g-1量进行腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于手术板，颈部常规消毒后备皮，于颈部正中切口，用棉签钝性分离肌肉，暴露出右侧颈总动脉，分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈总动脉近心端，于结扎处上端剪口，将线栓插入剪口处并进线（在线栓近头端1.5 cm处标记，进线时标记点到达Y型分支口即可），缝合，消毒，每只大鼠术后补充5 mL生理盐水，2 h后拔出线栓进行再灌注。

根据Longa Z 的5 分制法进行神经功能损伤评分[16]，选取1-2分的动物随机分组，在拔线2 h后，每只由尾静脉注射含1.0×106个细胞的bMSCs细胞或诱导后bMSCs细胞悬液1 mL（由PBS作溶剂），假手术组与模型组注射等量PBS。术后2 h，1天，3天，5天，7天对动物进行神经功能评分。于造模7 天后，处死大鼠并取脑，对大脑行TTC染色及HE染色，并采用干湿重法测量脑组织含水量。

1.2.5 统计学分析

采用SPSS 17.0对数据进行单因素方差分析，数据结果以均数 标准差（xˉ)表示，P ＜0.05表示有显著性差异，有统计学意义。

2 结果

2.1 木香烃内酯对bMSCs毒性检测

bMSCs 的存活率通过MTT 实验检测（图1），随木香烃内酯浓度增加，细胞在2-10 μM 浓度范围内存活率均高于90%，而浓度超过10 μM 时细胞存活率明显下降。说明木香烃内酯浓度在10 μM 以上时，具有较大的细胞毒性。因此，本实验中选择浓度为10 μM 的木香烃内酯对bMSCs进行诱导。

2.2 诱导后bMSCs形态学研究

bMSCs形态学变化用于评价木香烃内酯对bMSCs向神经样细胞的诱导作用。光镜下观测结果（图2），在0-24 h间，细胞由图A到图D，形态逐渐拉长并出现细胞分支，表现出神经细胞样形态。

通过细胞骨架（β-actin）染色对细胞形态进一步观察（图3），细胞在木香烃内酯作用下，由图A 中梭型、无分支样逐渐变化为图D中较长且有分支的形态，呈神经细胞样。骨架染色结果与光镜下观察结果一致。表明在木香烃内酯的条件诱导下，bMSCs 逐渐向神经样细胞分化。

2.3 神经细胞标志蛋白免疫荧光染色

神经元特异性蛋白NSE、Nestin 和星型胶质细胞特异性蛋白GFAP是用来检测干细胞诱导分化后是否存在神经样细胞的指标[17]。染色结果（图4），与空白组相比，木香烃内酯诱导bMSCs 后三种神经细胞标志蛋白的表达量均有升高，其中蛋白GFAP 和Nestin 的表达量在诱导后24 h达到峰值，蛋白NSE 的表达量在诱导后12 h 达到最高值。证明bMSCs 在经木香烃内酯诱导后逐渐向神经样细胞分化，且最终确定诱导条件为10 μM木香烃内酯孵育细胞24 h。

2.4 神经功能损伤评分

术后动物根据Longa Z 的5 分制法进行神经功能损伤评分（表1），术后2 h及1天内，MSC组及诱导组动物的评分有所降低，但与模型组相比无显著性差异（P ＞0.05）；术后5天、7天内，与模型组相比，MSC组评分有明显下降（P ＜0.05），而诱导组评分与模型组相比差异更加明显（P ＜0.01）。

图1 木香烃内酯对bMSCs细胞毒性测定

图2 光学显微镜下观察bMSCs形态学变化（×100）（A：空白组；B：诱导4 h；C：诱导12 h；D：诱导24 h）

图3 bMSCs细胞骨架染色免疫荧光检测（×400）（A：空白组；B：诱导4 h；C：诱导12 h；D：诱导24 h）

图4 诱导后bMSCs细胞NSE，GFAP及Nestin免疫荧光染色（×200）（A：空白组；B：诱导4 h；C：诱导12 h；D：诱导24 h）

表1 术后动物神经功能损伤评分（n=10）

2.5 TTC染色，脑梗死体积及脑组织含水量

术后7 天，脑梗死情况（图5），MSC 组及诱导组大鼠脑梗死体积明显小于模型组，且诱导组大鼠脑梗死体积相较于MSC 组有明显减小。诱导组大鼠脑部梗死体积为14.76%±0.56，与模型组相比明显下降，且有显著性差异（P ＜0.01）；MSC 组脑部梗死体积为23.15%±0.08，与模型组相比有所下降，但无显著性差异（P ＞0.05）；诱导组大鼠脑部梗死体积与MSC组相比也有显著下降（P ＜0.01）。模型组大鼠脑组织的含水量为81.19%±0.27，与假手术组相比明显增加，有显著性差异（P ＜0.05）；MSC组脑组织含水量为80.80%±0.20，与模型组相比有所下降，但无显著性差异（P ＞0.05）；诱导组大鼠脑组织的含水量为78.93%±0.38，与模型组相比明显下降，且有显著性差异（P ＜0.05），与MSC 组相比也有显著性差异（P ＜0.05），说明bMSCs与诱导后bMSCs均可使脑缺血损伤大鼠脑梗死体积减小并降低脑含水量，且诱导组效果优于MSC组（表2）。

2.6 HE染色

大鼠脑缺血半暗区组织学观察显示（图6），假手术组神经元细胞结构正常，排列整齐紧密，染色均匀，细胞核大而圆；模型组神经元细胞结构损伤，可见神经元细胞核出现明显固缩和深染，细胞间质水肿，结构疏松；MSC组与诱导组均可见大鼠缺血半暗带区固缩、浓染神经元减少，组织间隙水肿减轻，但两组相比，诱导组缺血半暗带区恢复效果优于MSC 组。以上实验结果说明，诱导后的bMSCs 对脑缺血再灌注损伤的治疗作用更加明显。

图5 术后动物脑组织TTC染色（白色为梗死部位，红色为正常部分）

3 讨论

干细胞用于心脑血管疾病治疗是近年来的研究热点[18]。在针对脑缺血的治疗中，主要有注射神经干细胞[19,20]及注射bMSCs[21,22]两种研究方向。但外源神经干细胞主要来源于胚胎或胎儿，其应用广受争议，而骨髓间充质干细胞可从自体器官获得，无伦理争议，且无需进行免疫抑制治疗[23]，是当下干细胞治疗领域的研究重点。2000 年左右，bMSCs 向神经细胞样分化的实验是在体内进行的，Kopen 等将标记的大鼠bMSCs 直接注射入新生小鼠的侧脑室发现其能在脑微环境影响下分化为神经样细胞[24]，但bMSCs 细胞在体内的分布及分化存在多种可能性，难以完全向预期方向发展。随着研究的深入，Woodbury等报道bMSCs可通过体外诱导向神经样细胞分化[6]。bMSCs 在体外分化为神经样细胞后，会有较好的脑靶向性，能更多地分布在脑病灶部位，发挥更加有效的治疗作用[25]。

胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞活化的标志物；神经元特异性烯醇化酶（NSE)是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶；巢蛋白（Nestin）是一种中间丝类型的蛋白，为神经干细胞的*P ＜0.05，**P ＜0.01：与模型组相比；&P ＜0.05，与假手术组相比；#P ＜0.05，##P ＜0.01，与MSC组相比。特征性标志物[26,27]。这三种蛋白是用于证明干细胞经诱导后向神经细胞分化的主要标志蛋白[28]。本研究中发现随木香烃内酯对bMSCs 诱导时间的延长，细胞形态逐渐拉长并出现分支，表现出神经样细胞形态，同时NSE，GFAP 及Nestin 三种神经细胞标志蛋白的表达量也有所上调，证明木香烃内酯可诱导bMSCs 向神经样细胞分化。在此基础上，利用脑缺血再灌注大鼠模型对诱导后bMSCs 的治疗效果进行验证，由神经功能损伤评分可见诱导组动物术后神经恢复情况较MSC 组更佳，且状态更活跃，能主动进食饮水。脑梗死体积与脑含水量结果显示，诱导组及MSC组皆可减轻术后脑部损伤，而两组对比，诱导组动物脑梗死体积的减小及脑含水量的降低均更为显著。由脑组织HE染色结果可知，诱导组及MSC组大鼠的缺血半暗带组织结构均有不同程度的恢复，其中诱导组病灶部位的神经元较完整、组织更加紧密。通过对两组治疗结果进行对比，可见诱导组的治疗效果明显优于MSC组。

表2 术后动物脑梗死体积及脑组织含水量变化（n=10）

图6 大鼠脑组织HE染色（×50）（A：假手术组；B：模型组；C：MSC组；D：诱导组）

综上所述，bMSCs 经木香烃内酯诱导后可向神经样细胞分化，且用诱导后bMSCs 治疗脑缺血可显著降低病灶部位的损伤。干细胞治疗这一领域仍有无限潜能，今后可能会为治疗心脑血管疾病提供更好的方向与思路，具有很高的临床价值。