微波辅助提取－分散固相萃取净化－超高效液相色谱－串联质谱法测定畜禽肉中的7种非选择性环氧化酶抑制药物残留

励 炯，林伟杰，曹青文，金朦娜，邱红钰

（杭州市食品药品检验研究院，浙江杭州310017）

非选择性环氧化酶（COX）抑制药物是属于非甾体类抗炎药物（Nonsteroidal Anti－Inflammatory Drugs，NSAIDs）中的一大类药物，具有抗炎、止痛和解热功能，临床上主要应用于缓解肌肉、关节及炎症免疫性疾病的局部疼痛、肿胀等治疗［1－3］。由于非选择性COX抑制药物价格低廉、疗效好，被广泛应用于养殖业中，用于食源性动物的感染性炎症的预防和治疗［4］。近年来，非选择性COX抑制药物在禽畜类养殖业中有滥用的趋势，而食用含有非选择性COX抑制药物残留的肉类产品会对机体产生极大的副作用。欧盟已经规定了部分非选择性COX抑制药物的最大残留量［5－7］。

水体中非选择性COX抑制药物的检测研究已经有很多文献报道［8－10］，但由于畜禽肉基质的复杂性，没有检测畜禽肉中较低含量非选择性COX抑制药物残留的相关报道。复杂基质的样品，比如土壤中非选择性COX抑制药物的检测方法已有研究［11－14］，其前处理方法主要通过溶剂萃取［15］、微波辅助提取［16］、超声提取［17］、加压溶剂萃取［18］、QuEChERS法［19］等来提取非选择性COX抑制药物残留。样品经提取后，用一定填料的固相萃取（SPE）进行净化处理。而检测方法有气－质（GC－MS）联用法［20－21］、高效液相色谱法（HPLC）［22－23］以及液－质（HPLC－MS／MS）联用法［24－26］。本文通过用微波辅助萃取，结合分散固相萃取（MAE－DSPE），对畜禽肉中非选择性COX抑制药物残留进行提取及净化，采用兼顾灵敏度高及抗干扰性强的超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS／MS），对畜禽肉中的7种非选择性COX抑制药物残留进行定性定量分析。本法简便、灵敏、高效，可满足畜禽肉的质量监测需求。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6425串联四极杆质谱仪（美国，Agilent公司）；Mars 5高压微波消解仪（美国，CEM公司）；MultiReax萃取仪（德国，Heidolph公司）；Mili－Q去离子水发生器（美国，Millipore公司）；MS3旋涡混合器（德国，IKA公司）。

标准品：水杨酸、布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛、吡罗昔康、萘普生和保泰松，均购自中国食品药品检定研究院；甲酸铵、NaCl、无水MgSO4、无水Na2SO4、无水柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠（分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司）；乙腈、甲酸、乙酸乙酯、丙酮（色谱纯，德国Merck公司）；十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）和NH2－丙基乙二胺吸附剂（NH2－PSA）购自上海岛津技术公司。

1．2 样品前处理

1．2．1 提取 精密称取5．0g猪肉，置于高压微波消解罐中，加入85%乙腈水溶液（pH＝2）10mL，微波提取功率为400W，经8min温度由室温升至90℃，然后90℃保持15min进行提取，冷却后置于50mL聚氟乙烯离心管中，加入6g无水 MgSO4，1．5g NaCl，1．5g无水柠檬酸钠和0．75g柠檬酸氢二钠，漩涡振荡1min。将有机相层移入一新的50mL聚氟乙烯离心管中，待净化。

1．2．2 净化 在待净化样液中加入净化剂（内含2 000mg无水 Na2SO4、500mg C18及300mg NH2－PSA），旋涡混匀1min，以4 000r／min的速度离心5min后，全部转移至试管中，于40℃水浴下氮吹至近干。加入1mL含0．1%甲酸的水溶液－含0．1%甲酸的乙腈溶液（90∶10，V／V），旋涡混匀1min溶解残渣，用0．22μm微孔有机滤膜过滤。

1．3 仪器条件

1．3．1 色谱条件 Waters CORTECS C18色谱柱（100×2．1mm，1．7μm）；流动相：A 相为含0．1%甲酸的水溶液，B相为含0．1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～8min，90%～45%A；8～9min，45%A；9．1～12min，90%A。柱温：40℃；流速：0．4mL／min，进样量1μL；运行时间：12min。

1．3．2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI＋和ESI－）；多反应监测（MRM）模式；干燥气温度：200℃；干燥气流速：14L／min；毛细管电压：3．5kV；毛细管出口电压（Fragmentor）：380V；校准方法：质量轴自动调谐校正；MRM 进行分段扫描：0～4．5min，水杨酸；4．5～6．0min，吡罗昔康；6．0～7．5min，萘普生；7．5～8．85min，吲哚美辛、双氯芬酸钠和布洛芬；8．85～12．0min，保泰松。其他质谱分析参数详见表1。

表1 7种非选择性COX抑制成分的质谱分析参数Table 1 MS parameters of 7non－selective cyclooxygenase inhibitors

2 结果与讨论

2．1 质谱和色谱条件优化

除了吡罗昔康和保泰松两种成分在ESI＋模式下的灵敏度较ESI－模式高，其余5种非选择性COX抑制剂在ESI－模式下灵敏度较高，在各自的模式下以m／z100～400扫描范围下对7种目标物进行一级质谱扫描，得到精确的母离子质荷比，优化毛细管电压后，进一步对7种目标物的二级质谱参数进行优化，详细参数参见表1。其中布洛芬的碎片离子只有一个，所以本文采用一个离子通道对畜禽肉中的布洛芬进行检测。

流动相中加入一定量的挥发性酸或者挥发性盐，能够增强目标化合物的离子化程度，而在ESI－模式下，流动相中加入一定量的甲酸可以提高分析物的灵敏度［25］。据此本文考察了以下三组流动相下的色谱行为：（1）A为含0．1%甲酸的水溶液，B为含0．1%甲酸的甲醇；（2）A为含0．1%甲酸的水溶液，B为0．1%甲酸的乙腈溶液；（3）A 为含0．1%甲酸的5mmol／L甲酸铵溶液，B为0．1%甲酸的乙腈溶液。结果发现将流动相（2）作为分析7种非选择性COX抑制剂的流动相时，7种目标物峰形较好，灵敏度满足要求。7种非选择性COX抑制剂的MRM色谱图见图1。

2．2 提取方式的优化

本文首先对提取溶剂进行考察，选用了三种常用的提取剂，包括乙腈、乙酸乙酯、丙酮进行回收率实验，结果发现采用乙腈作为提取溶剂时7种目标化合物的回收率均达到80%以上，而采用乙酸乙酯和丙酮提取时，布洛芬和萘普生的回收率均低于20%。已有文献报道采用微波辅助提取时，加入一定比例的水，有助于目标化合物的提取效率［11］。所以本文采用80%、85%、90%、95%、100%5组比例的乙腈水溶液进行回收率考察，结果发现当乙腈比例为85%时，7种目标化合物的回收率均高于80%，其余4组比例提取的布洛芬和萘普生的回收率普遍低于75%。除了有机溶剂类型和水的比例能影响目标化合物的提取效率，还有文献报道提取溶剂中水的pH值也会影响回收率［12］，所以本文用1mol／L HCl调成4组不同的pH值（分别为2、3、4、5）的去离子水，配制成85%乙腈水溶液，结果当水的pH值为2时，7种目标化合物的回收率均最高，达到80%。所以本文采用85%乙腈水溶液（pH＝2）作为畜禽肉类中的7种非选择性COX抑制药物的残留的提取溶剂。

同时我们对加入的提取盐组分进行考察，采用4组比例：（1）6g无水 MgSO4＋1．5g NaAc；（2）4g无水 MgSO4＋1g NaCl；（3）6g无水 MgSO4＋1．5g NaCl＋1．5g无水柠檬酸钠＋0．75g柠檬酸氢二钠；（4）4g无水MgSO4＋1g NaCl＋1g无水柠檬酸钠＋0．5g柠檬酸氢二钠。结果发现加入第3组比例的7种目标物回收率最高，均高于80%，其余3组的双氯芬酸钠的回收率均低于70%。所以本文采用6g无水 MgSO4，1．5g NaCl，1．5g无水柠檬酸钠和0．75g柠檬酸氢二钠组成的4种盐进行提取。

图1 7种非选择性COX抑制成分（20μg／L）的 MRM色谱图Fig．1 MRM chromatograms of 7non－selective cyclooxygenase inhibitors（20μg／L）Peak identifications：1．salicylic acid；2．ibuprofen；3．naproxen；4．diclofenac sodium；5．phenylbutazone；6．piroxicam；7．indometacin．

2．3 净化方式的优化

本文同时考察了两种常见的净化方式，包括分散固相萃取（DSPE）和固相萃取（SPE）净化。分散固相萃取净化见1．2节，SPE采用Oasis HLB固相萃取柱进行回收率考察。结果发现当用Oasis HLB固相萃取柱进行净化后，布洛芬和双氯芬酸钠的回收率均低于10%，所以本文采用DSPE净化法，提取液中加入内含2 000mg无水Na2SO4、500mg C18及300mg NH2－PSA组成的净化剂进行净化，7种目标化合物回收率均高于80%。

2．4 线性关系与检出限

采用猪肉空白基质配制10、20、50、80、100、200μg／L的基质标准系列溶液，以定量监测离子对的离子流中谱峰峰面积（Y）为纵坐标，标准溶液浓度（X，μg／L）为横坐标进行线性关系考察，结果见表2。7种非选择性COX抑制剂在各自线性范围内线性关系较好（r2均大于0．9965）。

取空白样品（检测结果为阴性的猪肉），加入适当稀释的混合标准品溶液，按样品制备方法制备供试品溶液，得信噪比为3和10时分别为7种非选择性COX抑制剂的检测限（LOD）与定量限（LOQ），结果见表2。

表2 7种非选择性环氧化酶抑制剂的线性关系、检测限和定量限Table 2 Regression equation，limits of detection and（LOD）and limits of quntifacation（LOQ）of 7non－selective cyclooxygenase inhibitors

2．5 方法回收率与精密度

取空白样品（检测结果为阴性的猪肉），分别在5、10、20μg／kg 3个添加水平下进行加标回收率实验，平行6份，结果见表3。7种非选择性COX抑制剂的三个浓度水平的平均回收率为81．3%～93．8%，相对偏差（RSD）为2．5%～7．6%。

表3 猪肉中7种非选择性COX抑制剂的回收率与精密度试验（n＝6）Table 3 The recoveries and precision of 7non－selective cyclooxygenase inhibitiors in pork（n＝6）

2．6 实际样品检测

利用本文建立的方法完成了50批次的畜禽肉产品（包括10批次猪肉，10批次牛肉，10批次羊肉，10批次鸡肉，10批次鸭肉）中7种非选择性COX抑制药物残留情况的检测，其中一批次的猪肉中检出布洛芬16μg／kg，一批次的牛肉检出双氯芬酸钠12μg／kg，检出样品的MRM色谱图详见图2。

图2 阳性样品的MRM色谱图（A为猪肉，B为牛肉）Fig．2 MRM chromatograms of positive samples（A：pork；B：beef）

3 结论

本研究建立了微波辅助提取－分散固相萃取净化－超高效液相色谱－串联质谱法测定畜禽肉类产品中7种非选择性COX抑制剂残留的分析方法，优化了仪器条件和样品前处理条件。以85%乙腈水溶液（pH＝2）作为提取剂，经微波辅助提取，再加入6g无水 MgSO4，1．5g NaCl，1．5g无水柠檬酸钠和0．75g柠檬酸氢二钠组成的4种盐进行提取，再使用2 000mg无水 Na2SO4、500mg C18以及300mg NH2－PSA组成的净化剂进行净化处理。本方法简单、高效，有效地降低了基质效应，提高了分析方法的选择性和灵敏度，为畜禽肉中7种非选择性COX抑制药物残留的检测提供了一种较好的方法