蛹虫草子实体中类胡萝卜素的组成与特性研究

洪 健 王化梅 向晓琴 雷 灿⋆

（生物资源保护与利用湖北省重点实验室（湖北民族大学） 湖北恩施 445000）

蛹虫草属于子囊菌纲麦角菌科，是一种药食两用型真菌。近年来在国内外受到了广泛关注。蛹虫草的药用功能很多，如抗炎，[1]抗氧化，抗衰老，[2]抗癌等作用。蛹虫草内含有多种活性成分，如虫草多糖，虫草素，虫草酸，类胡萝卜素等，其中腺苷，虫草素和虫草类胡萝卜素被认为是蛹虫草的主要活性物质。[4]目前，对于蛹虫草已经进行了大规模的人工培养，以期生产保健食品和获得虫草素、腺苷等生物活性成分。

类胡萝卜素具有抗癌、抗氧化和增强视力等功能。蛹虫草子实体内含有丰富的类胡萝卜素，可以作为类胡萝卜素的食品补充剂。根据董静洲[3]等人的研究证实蛹虫草子实体经过短波光刺激照射，其子实体中类胡萝卜素的含量明显增加，然而类胡萝卜素的化学组成和化学特性尚不清楚。本文研究发现了蛹虫草子实体中类胡萝卜素的组分、溶解性和定量方法，为蛹虫草子实体的生产和利用提拱理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草由湖北省圣峰药业有限公司提供；β-胡萝卜素标准品；乙腈、乙酸均为色谱纯，购自DIKMA公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

超声波清洗机（深圳洁泰超声洗净设备有限公司）；高效液相色谱仪（ 杭州赛智科技有限公司）；液相色谱-质谱联用仪（ 赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；制备型高效液相色谱（杭州赛智科技有限公司）；紫外可见光分光光度计；滤膜。

1.3 方法

1.3.1 色谱分析条件。HPLC色谱柱：C18硅胶色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.5 %乙酸溶液，梯度洗脱见表1；柱温25 ℃；样品进样量 20 μL；流速1 mL/min。

表1 高效液相色谱梯度洗脱条件

1.3.2 样品预处理及样品测定。蛹虫草子实体的制备采用董静洲的方法，[3]当蛹虫草子实体表面覆满金黄色孢子后，收获子实体，并用硅胶干燥至恒重。将干燥后的蛹虫草子实体打成粉末，过60目筛备用。

称取0.5 g蛹虫草子实体粉末溶于10 mL 80 %的乙醇溶液中，在3250 r/min条件下离心10 min，上清液过0.22 μm的滤膜（直径5cm，上海市新亚净化器件厂），将滤液置于紫外分光光度计上进行光谱扫描，得到相应吸收峰；主吸收峰出现在425 nm，447 nm和475 nm（见图1-A），这三个吸收峰皆为类胡萝卜素的典型吸收光谱。滤液再经HPLC进行分离。经HPLC分离得到的单体组分由华中科技大学分析测试中心进行LC-MS分析。各单体组分的分子质量和化学结构由质谱图与紫外数据分析得出（见表2和图1）。

1.3.3 类胡萝卜素中各组分水溶性分析。称取0.5 g研磨后的蛹虫草子实体粉末，分别用10 mL浓度为0 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %和100 %的乙醇溶液进行浸提，浸提时间为12 h，提取物过滤膜（孔径0.22μm，直径：5cm，上海市新亚净化器件厂），滤液通过高效液相色谱仪进行分析。以提取率来确定类胡萝卜素中各组分的水溶性。

1.3.4 标准溶液的配置及各单体组分标准曲线的制作。以β-胡萝卜素作为标准品，将其溶解于60 %的乙醇溶剂中，分别配置浓度为0.5，1，1.5，2，2.5， 3，3.5，4，5 μg/mL的标准液，检测波长为447 nm。得到标准曲线为：Y= 0.157X + 0.0049，相关系数r2 = 0.9998，此处Y为吸光度，X为标准液的浓度。分析并计算回收率、精确度和准确度。

称取200 g蛹虫草子实体粉末，用60 %乙醇溶液进行提取，参照1.3.1中色谱的条件进行分离，用PHPLC分离出蛹虫草中类胡萝卜素，分别收集各单体组分，经60 ℃真空干燥至恒重，然后利用利用HPLC做出此四种类胡萝卜素的标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 蛹虫草类胡萝卜素的化学组分分析

经HPLC分析，蛹虫草子实体粉末中类胡萝卜素出现4个主峰（见图1-C），采用PHPLC分离得到这4种类胡萝卜素的单体后，经60 ℃真空干燥至恒重，溶于甲醇后在紫外分光光度计上进行光谱扫描，得到此4种类胡萝卜素有相同吸收光谱（见图1-B）,这表明此4种类胡萝卜素有相同的共轭系统。

图1 蛹虫草类胡萝卜素的紫外可见光谱和HPLC扫描

注：检测波长447 nm；A：蛹虫草子实体总提物的紫外可见光谱； B：4种虫草黄素的紫外光谱； C：蛹虫草类胡萝卜素的HPLC分离结果；峰1：虫草黄素-Ⅰ； 峰2：虫草黄素-Ⅱ； 峰3：虫草黄素-Ⅲ；峰4：虫草黄素-Ⅳ

如表2所示，这四种类胡萝卜素单体在质谱数据上均存在共有碎片，表明它们具有相同的共轭系统，差异碎片则是共轭系统两侧不同的官能团。

表2 四种虫草黄素的紫外-质谱数据

根据质谱数据（见表2）和紫外光谱数据（见图1-B），可以推出这4种类胡萝卜素是黄素类物质，结合IUPAC-IUB 规定的类胡萝卜素命名方法，将这4种类胡萝卜素单体命名为虫草黄素，它们的具体结构分别为：cordyxanthin-Ⅰ，cordyxanthin-Ⅱ，cordyxanthin-Ⅲ和cordyxanthin-Ⅳ。这四种虫草黄素的化学结构式如图2所示。

2.2 四种虫草黄素的水溶性分析

四种虫草黄素水溶性分析结果见图3。随着乙醇溶液的浓度的增大，4种虫草黄素的提取率逐渐增加，当乙醇溶液达到60 %时，虫草黄素的提取率达到最大，随后提取率逐渐下降，乙醇浓度达到100 %时，其溶解度降至最低。然而β-胡萝卜素是脂溶性的，其在无水乙醇中的溶解度最大，[6]这表明此4种虫草黄素具有很强的水溶性。在实际应用中，把干燥后的蛹虫草子实体加入到沸水中进行冲泡，水的颜色渐渐变为深黄色，这一现象也说明了蛹虫草子实体中含有的虫草黄素溶入到了热水中，表现出很强的水溶性，因而也易于被人体吸收。据此可以推测，在食品生产中虫草黄素可以作为优质的色素来源和类胡萝卜素的强化剂。

图2 四种虫草黄素的化学结构

据文献[6]报道，在柞蚕培养基上生长的蛹虫草，其子实体中主要的类胡萝卜素是叶黄素。本实验中采用的是米饭培养基，在子实体中未检测到叶黄素，这可能是因为培养基营养成分的不同而导致子实体类胡萝卜素组分的差异。通过与叶黄素的结构进行对比发现，4种虫草黄素甲基量减少，水溶性增强。将这4种虫草黄素溶于石油醚中，经紫外分光光度计扫描，未检测到类胡萝卜素的吸收光谱（图4），进一步证明了这4种虫草黄素具有很强的水溶性。

图3 子实体在不同乙醇浓度中的提取率

据报道，类胡萝卜素如β-胡萝卜素、叶黄素和番茄红素等普遍具有较强的抗癌活性。[2-4]与β-胡萝卜素、叶黄素和番茄红素相比较，虫草黄素的水溶性很强，理论上虫草黄素可能在抗癌方面也有很强的生物活性。因此值得进一步的研究。

2.2 蛹虫草类胡萝卜素各组分的定量分析

图4 子实体石油醚提取物紫外可见光谱扫描

功能食品的质量控制中，功能成分定量分析是至关重要的。本文中以β-胡萝卜素作为标准品建立了蛹虫草类胡萝卜素的直接量化方法。回收率为99.79-102.13 %，精密度为0.19-1.01 %，准确性为99.13%-109.3 % （表3），这些数据表明即使子实体提取物中有其他化学成分，也可以采用直接鉴定的方法来检测虫草类胡萝卜素的含量。我们测得蛹虫草类胡萝卜素的含量为1.27 mg/g干燥子实体，其中虫草黄素III含量最多，有0.401 mg/g干燥子实体，虫草黄素Ⅳ含量最少，只有0.175 mg/g干燥子实体，4种虫草黄素占总虫草类胡萝卜素含量的86.7 %。

3 结论

蛹虫草类胡萝卜素经分离和鉴定得到4种虫草黄素类单体，分别命名为cordyxanthin-Ⅰ,cordyxanthin-Ⅱ, cordyxanthin-Ⅲ和 cordyxanthin-Ⅳ，其中虫草黄素III含量最多。与常见的脂溶性类胡萝卜素如β-胡萝卜素、叶黄素和番茄红素相比较，虫草黄素具有很强的水溶性，更容易被人体吸收，在食品工业中可以作为优质色素来源和类胡萝卜素强化剂进行开发利用。以β-胡萝卜素作为标准品，可以在447 nm处检测总虫草黄素的含量。

表3 四种虫草黄素的量化检测