胶冻样类芽孢杆菌菌粉的研制及功能菌株的存活性研究*

张爱民，李乃康，曹丹丹，张璐琳

(1.河北大学生物技术研究中心 河北保定 071051； 2.河北大学生命科学学院 河北保定 071051； 3.苏州工业园区报关有限公司 江苏苏州 215000)

胶冻样类芽孢杆菌是一种能够分解硅酸盐矿物的细菌，因此一些学者将其称为硅酸盐细菌。由于该菌株具有分解钾长石、云母等铝硅盐类原生质态矿物的能力，使土壤中的不溶性K、P、Si等转变为可溶性元素供植物利用，同时还可产生多种生物活性物质以促进植物生长，因而其在农业上获得了广泛应用。除此之外，该菌株还广泛应用于采矿、冶金、制药等领域[1]。

以胶冻样类芽孢杆菌为出发菌株，可以研制出应用于农业生产的微生物菌剂，但由于该菌株发酵有效活菌数低，致使在实际应用中的接种数量与其他农用微生物菌株相差较大，限制了该菌株在农业生产上的应用[2]。河北大学生物技术研究中心的技术人员创造性地采用现代生物分离技术，利用胶冻样类芽孢杆菌内生芽孢具有耐高温、高压、干燥、氧化等不良因素的特性，采用喷雾干燥工艺研制出高含量胶冻样类芽孢杆菌菌粉制剂[3]。

随着我国现代高产优质高效农业的发展，要求肥料的研制向有机-无机-生物方向发展，其中关键因素是耐高渗透压微生物菌株的筛选，以便更好地与化学肥料协同作用。笔者研究了将胶冻样类芽孢杆菌菌粉与化肥及草炭配伍研制出复合微生物肥料及功能胶冻样类芽孢杆菌菌株的存活情况，为胶冻样类芽孢杆菌菌粉肥料制剂在化肥工业中的应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)菌种：胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)HB- 02，河北大学农业生态与环保实验室保存。

(2)其他原料：草炭(165 μm/100目)，河北满城国兴草炭加工厂；化学肥料，购自河北农业大学科技市场。

(3)检测培养基：蔗糖5.000 g，Na2HPO4·12H2O 2.000 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，FeCl3·6H2O 0.005 g，CaCO30.100 g，琼脂18.000～20.000 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH 7.5～8.0。

1.2 主要仪器和设备

LPR300喷雾干燥机，无锡闻华干燥设备有限公司；DHC- 500型碟片式离心机，辽阳市制药机械厂；BN0203型电子天平，上海民侨精密科学仪器有限公司；DH- 500型恒温培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司；HZQ- F160型恒温振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；LDZF- 50KB型全自动灭菌锅，上海申安医疗器械厂；UB100i型显微镜，重庆UOP光电技术有限公司。

1.3 方法

(1)菌落和菌体形态特征

取培养12 h胶冻样类芽孢杆菌的斜面，无菌操作涂片，经革兰氏染色后观察其菌体形态；同时在斜面中加入一定量的无菌水，涂布于检测培养基上，于32 ℃倒置培养36 h，观察其菌落形态。

(2)有效活菌数的测定及芽孢收率的计算

从发酵终点的胶冻样类芽孢杆菌发酵液中吸取5.0 mL于45.0 mL无菌水中，按1∶10进行梯度稀释，得到10-1，10-2，10-3，10-4……稀释度的菌悬液；每个样品取3个连续适宜的稀释度，用0.5 mL无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1 mL，均匀地涂布于检测培养基平板上；每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于32 ℃培养48 h，以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，统计有效活菌数。

芽孢收率为喷雾干燥后得到产品的生物量与喷雾干燥前生物量的比值，按式(1)计算：

(1)

(3)发酵液的浓缩处理技术

胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株在20 m3发酵罐发酵到终点的发酵液采用碟片式离心机进行浓缩处理，为下一步发酵液的喷雾干燥处理提供准备。

(4)进风温度对芽孢生物量及收率的影响

设定喷雾干燥塔的进风温度分别为110、130、150和170 ℃，干燥后进行芽孢收率的测定，进而确定胶冻样类芽孢杆菌喷雾干燥的理想进风温度。

(5)通风量对芽孢生物量及收率的影响

设定喷雾干燥塔的通风量分别为10、15、20以及25 m3/min，干燥后进行芽孢收率的测定，进而确定胶冻样类芽孢杆菌喷雾干燥最适宜的通风量。

(6)进料速率对芽孢生物量及收率的影响

设定喷雾干燥塔的进料速率分别为0.50、0.75和1.00 t/h，干燥后进行芽孢收率的测定，进而确定胶冻样类芽孢杆菌喷雾干燥较为理想的进料速率。

(7)3批次发酵液喷雾干燥结果

采用20 m3发酵罐进行了3批次试验，装料体积占发酵罐总容积的65%。发酵结束后，首先进行离心浓缩，然后加入填充剂，再进行喷雾干燥，最后测定其芽孢收率及有效活菌数。

(8)HB- 02菌株在不同复合微生物肥料中的存活率

从河北农业大学科技市场购买的氮肥、磷肥及钾肥按一定质量比与草炭及保护剂混合后，得到不同N、P2O5、K2O含量及有机质含量的有机-无机混合物，然后加入40.0 g通过上述喷雾干燥工艺研制的高含量胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株菌粉(50.0×108cfu/g)，制成不同N- P2O5- K2O含量的复合微生物肥料。试验共设T1、T2、T3、T4和T55个处理，每个处理样品质量为500.0 g，3次重复，分别装入无菌聚丙烯袋中密封常温保存，在不同时间取样测定胶冻样类芽孢杆菌的有效活菌数。T1、T2、T3、T4和T5的N、P2O5和K2O含量如下：T1，w(N+P2O5+K2O)=0%；T2，w(N+P2O5+K2O)=8%；T3，w(N+P2O5+K2O)=15%；T4，w(N+P2O5+K2O)=25%；T5，w(N+P2O5+K2O)=30%。

2 结果和讨论

2.1 胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株的菌落和菌体形态特征

如图1所示，在检测培养基上，胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株的菌落表面光滑，边缘整齐，无色透明，湿润有光泽，隆起，质地黏稠，有弹性，挑起时可拉成丝。

图1 胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株的菌落形态

图2 胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株的菌体形态

如图2所示：培养12 h的胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株经革兰氏染色以后，菌体呈粗长杆状，末端圆形，大小为(1.0～1.8) μm×(3.0～7.0) μm，革兰氏染色阴性，菌体中常有1～2个大脂肪颗粒；培养后期在菌体中形成芽孢，芽孢处于中央或亚中央，椭圆形，大小为(1.5～2.0) μm×(2.0～3.5) μm，胞囊膨大后不成梭形；在营养贫乏时，菌体外包有2～4层椭圆形肥大荚膜，大小为(15.0～20.0) μm×(20.0～35.0) μm，而在营养丰富时形成的荚膜较小或不形成荚膜。

2.2 胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株发酵液的浓缩处理

发酵液浓缩处理的目的在于缩短喷雾干燥后的处理时间，减轻后处理压力，以便得到高含菌量的菌粉产品。当胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株到达发酵终点后，首先将发酵液转至储罐，然后选用DHC- 500型碟片式离心机进行离心浓缩，在得到的浓缩液中加入一定量的环糊精(目的是减轻浓缩液在喷雾干燥过程中的黏壁现象)后，进入喷雾干燥塔进行气流干燥处理。

2.3 进风温度对胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株喷雾干燥芽孢收率的影响

首先设定胶冻样类芽孢杆菌浓缩液喷雾干燥的进料速率为0.5 t/h，通风量为15 m3/min。在该条件下，将进风温度分别设定为110、130、150和170 ℃，通过LPR- 300型喷雾干燥机进行干燥处理。通过3批次试验表明：进风温度为110～130 ℃时，黏壁现象严重，不易收集成品；进风温度为170 ℃时，黏壁现象轻微，成品呈粉末状；进风温度为150 ℃时，能收集到粉末状的成品，存在轻微的黏壁现象，样品含水量低，菌粉的收集率在85%以上。因此，确定喷雾干燥处理的理想进风温度为150 ℃。

2.4 通风量对胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株喷雾干燥芽孢收率的影响

喷雾干燥处理时，胶冻样类芽孢杆菌浓缩液在进料速率为0.5 t/h、进风温度为150 ℃的条件下，通风量分别设定为10、15、20和25 m3/min，通过LPR- 300型喷雾干燥机进行干燥处理。试验表明：在通风量较低(10～15 m3/min)的情况下，黏壁现象严重；在通风量较高(25 m3/min)的情况下，不利于菌粉的收集；在通风量为20 m3/min条件下，集粉率较高，也不黏壁，菌粉收集率在85%以上。因此，确定喷雾干燥处理的理想通风量为20 m3/min。

2.5 进料速率对胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株喷雾干燥芽孢收率的影响

首先设定胶冻样类芽孢杆菌浓缩液喷雾干燥的进风温度为150 ℃，通风量为15 m3/min。在该条件下，进料速率分别为0.50、0.75和1.00 t/h，通过LPR- 300型喷雾干燥机进行进料干燥处理。试验表明：进料速率为0.50 t/h时，会使雾滴变小，喷出的雾滴过细、过轻，由于负压涡旋作用而导致雾滴黏在喷头上；进料速率为1.00 t/h时，单位时间内单位料液水分的蒸发量降低，雾滴变大，导致无法完全干燥雾滴，样品的含水量较高，容易堵塞喷头，挂壁现象严重，影响了产品的集粉率。因此，选择进料速率为0.75 t/h。

2.6 3批次胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株发酵液喷雾干燥处理结果

采用20 m3发酵罐进行了3批次试验，装料体积占发酵罐总容积的65%。发酵结束后，首先进行离心浓缩，然后加入填充剂，再进行喷雾干燥。喷雾干燥的工艺参数为进料速率0.75 t/h、通风量20 m3/min、进风温度150 ℃，此条件下3批次发酵液喷雾干燥后菌粉的检测结果如表1所示。

表1 3批次发酵液喷雾干燥后菌粉的检测结果

项目批次1批次2批次3平均发酵液体积/L13 65012 87013 56013 360有效菌含量/(×108,cfu/mL)12.012.511.612.0离心浆液体积/L1 2301 2251 3001 251含菌量/(×108,cfu/mL)118.3117.5108.2114.5收率/%88.889.589.489.2喷雾干燥菌粉质量/t503.0471.4504.9493.1有效菌含量/(×108,cfu/g)265.4273.7256.4265.1平均收率/%81.580.282.381.3

从表1可知，在进料速率0.75 t/h、通风量为20 m3/min、进风温度150 ℃条件下，3批次胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株发酵液喷雾干燥的平均收率为81.3%，平均有效活菌数达到265.1×108cfu/g。

在上述高浓度胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株菌粉中添加一定比例的辅料可以研制出含菌量为50.0×108cfu/g或100.0×108cfu/g的农用微生物肥料制剂菌粉，该制剂在农业生产上可以直接作为肥料使用，也可作为生产微生物菌剂、复合微生物肥料或生物有机肥的菌粉原料。

2.7 胶冻样类芽孢杆菌在不同复合微生物肥料中的存活性

通过上述方法制备的胶冻样类芽孢杆菌菌粉与不同复合肥复配研制出复合微生物肥料并在室温下保存，然后分别在第0、22、56、78和120 d时取样，采用平板法测定胶冻样类芽孢杆菌有效菌含量，该菌株在不同复合微生物肥料中的有效活菌数的变化如图3所示。

图3中处理T1、T2、T3、T4、T5的w(N+P2O5+K2O)分别为0%、8%、15%、25%和30%，5个处理的复合微生物肥料在室温下保存，随保存时间的延长，胶冻样类芽孢杆菌有效活菌数均呈下降趋势，但在120 d内下降量较小，其中T5的有效活菌数从起始的4.53×108cfu/g降至120 d的3.17×108cfu/g，存活率为89.8%；但从120 d 保存至170 d，除T1外，其他各处理的复合微生物肥料胶冻样类芽孢杆菌有效活菌数均呈现直线下降。根据该试验结果，可确定所研制出的复合微生物肥料的保质期应不超过120 d。

图3 胶冻样类芽孢杆菌在不同复合微生物肥料中的有效活菌数的变化

农业部行业标准《复合微生物肥料》(NY/T 798—2015)中规定粉剂复合微生物肥料标准保质期为不低于3个月，w(N+P2O5+K2O)不超过25%。该试验结果不仅提高了农业行业标准中复合微生物肥料中w(N+P2O5+K2O)不超过25%的规定，保障了农作物营养需求，而且延长了保存期，为复合微生物肥料在农业生产上的实际应用提供了有力保证[4]。

通过方差分析进一步研究复合微生物肥料中N、P2O5、K2O含量和保存时间对胶冻样类芽孢杆菌有效活菌数的影响，结果如表2所示。

表2 方差分析结果

源平方和自由度均方F值P(显著性)时间1 808.0895361.61811.9440.000浓度171.044442.7611.4120.237误差2 422.0228030.275总计119 892.00090

从表2可知：由于P时间=0.000<0.050。可知复合微生物肥料保存时间对胶冻样类芽孢杆菌有效活菌数的影响达到显著差异水平；而P浓度=0.237>0.05，说明复合微生物肥料的N、P2O5和K2O含量对胶冻样类芽孢杆菌有效活菌数的影响未达到显著性差异。

3 结语

胶冻样类芽孢杆菌HB- 02菌株发酵达到终点后，首先将发酵液转至储罐，然后进行离心处理，通过离心浓缩和喷雾干燥研制出高含量菌粉，该菌株最佳喷雾干燥条件为进料速率0.75 t/h、通风量20 m3/min、进风温度150 ℃。通过对3批次胶冻样类芽孢杆菌生物量的测定，在该工艺条件下芽孢平均收率在81.3%，平均有效菌数为265.1×108cfu/g。

w(N+P2O5+K2O)分别为0%、8%、15%、25%和30%的含胶冻样类芽孢杆菌复合微生物肥料于室温下保存，随保存时间的延长，其有效活菌数均呈现下降趋势，但在120 d内有效活菌数下降量较小，存活率基本在90.0%左右；但当保存时间从120 d延长至170 d，除不含化肥的处理外，其余各处理的有效活菌数均呈直线下降。依据试验结果，确定所研制出的复合微生物肥料的保质期为不超过120 d。

通过试验研究，为胶冻样类芽孢杆菌菌粉的工业化原料生产及复合微生物肥料的研制及保存提供了理论依据，但其在农业上的应用效果试验有待研究。